对甲基苯磺酸预处理玉米秸秆动力学及酶解特性研究

陈 力 匡奕山 张 希，3 李 军，*

（1.华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室，广东广州，510641；2.长沙理工大学化学化工学院，湖南长沙，410114；3.济南圣泉集团股份有限公司，山东济南，250204）

玉米秸秆等非木质纤维素资源是一种重要的可再生资源，其来源广、年产量大。开发利用非木质纤维素资源不仅可以缓解能源短缺，还可以减少因化石燃料使用带来的环境问题[1]。由于玉米秸秆等植物资源具有天然的顽抗结构，在对其进行转化利用前通常需要进行预处理。通过预处理对玉米秸秆进行高效清洁组分分离，再对其中的纤维素和半纤维素进行转化利用是目前主流的开发利用流程。目前，预处理方法种类繁多，如稀酸处理、碱处理、有机溶剂处理、离子液体处理、蒸汽爆破、生物降解等[2-4]。其中稀酸处理和蒸汽爆破对设备要求较高，预处理后的抑制物浓度较高；碱处理后的废液处理难度大；有机溶剂处理时毒性较大；离子液体处理的成本高，废液难回收；生物预处理的周期较长，不利于工业化应用[2-4]。

对甲基苯磺酸（p-TsOH）预处理是一种新的有机酸预处理方法[5-6]，该方法不仅操作简单，而且可以在温和条件（反应温度低于100℃和常压）下，同时脱除木质素和半纤维素，并对纤维素的降解较小。此外，由于低温下p-TsOH 在水中的溶解度较低，反应后预处理液中的p-TsOH 组分可以进行重结晶回收利用[5]。因此，p-TsOH 预处理被认为是一种高效、经济、绿色的预处理方法。Chen 等人[5]使用p-TsOH 预处理杨木，发现p-TsOH 可以在低温下（≤80℃）将杨木中木质素脱除90%左右；Ma 等人[7]使用p-TsOH 预处理小麦秸秆制备了木质素纳米材料，并通过脱木素因子（CDF）[6,8]和联合水解因子（CHF）[6,8-9]对p-TsOH预处理小麦秸秆中组分脱除动力学进行了研究。然而关于p-TsOH 预处理对玉米秸秆等农业废弃物资源组分分离及其反应动力学的研究报道较少。

本研究采用p-TsOH 预处理玉米秸秆，研究了3 个预处理因素（p-TsOH 质量分数、水解温度和水解时间）对玉米秸秆中三大组分分离的影响；通过SIMCA 软件分析3个因素对木质素和半纤维素脱除的影响，拟合得到木质素和半纤维素含量的回归方程。进一步使用两相模型，引入CDF 和CHF，对预处理过程木质素和半纤维素脱除动力学进行研究，并探究了预处理后残渣的酶解特性。本研究旨在实现温和的预处理条件下玉米秸秆组分的快速、高效分离，为非木质纤维素高效转化利用提供数据支撑和理论指导。

1 实 验

1.1 材料

玉米秸秆（全秆）产地为陕西省定边县。对甲基苯磺酸一水合物（p-TsOH·H2O，质量分数99.0%）、四环素、柠檬酸、柠檬酸钠均购于阿拉丁试剂公司。纤维素酶（C2730）购于诺维信公司，采用滤纸酶活法[10]测定酶活为160 FPU/g。

1.2 p-TsOH预处理玉米秸秆组分分离

p-TsOH 预处理玉米秸秆工艺中的3 个预处理因素具体实验条件为：p-TsOH 质量分数10%～70%，水解温度35～95℃，水解时间20～100 min。具体的预处理条件按照表1中设计以进行实验。

预处理实验：将200 mL 质量分数10%的p-TsOH溶液加入500 mL 锥形瓶后置于恒温水浴锅中，待溶液温度达到预定值后，搅拌速率设定为300 r/min，将研磨后10 g（绝干）玉米秸秆粉末加入锥形瓶中，并开始计时。到达预定水解时间后，趁热使用G2 砂芯滤器进行真空抽滤，收集滤出水解液，使用大量蒸馏水洗涤预处理后残渣至洗涤液为中性。取少量预处理后残渣分别进行冷冻干燥（-50℃，48 h）和真空干燥（45℃，24 h）。水解液中溶解的木质素通过稀释沉淀法回收利用、p-TsOH 通过减压蒸馏结晶后回用，而水解液中的半纤维素降解产物（如戊糖和糠醛等）通过膜过滤分离法回收[10-12]。

1.3 预处理后玉米秸秆残渣的酶解可及性

预处理后玉米秸秆三大组分含量发生了变化，进一步研究了预处理后不同组分含量的玉米秸秆残渣的酶解可及性，具体酶解工艺[13]为：将经冷冻干燥的50 mg（绝干）预处理后玉米秸秆残渣、800 μg 四环素依次加入空气摇床中的30 mL 锥形瓶里，计算并加入适量的pH 值=4.8 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液使得最终酶水解反应体系溶液总体积为10 mL。升温至50℃后，加入15 FPU/g（以纤维素质量计）的纤维素酶解液并开始计时，摇床转速为200 r/min，酶解时间为72 h。反应结束后，将酶解锥形瓶置于沸水中并保持5 min，使纤维素酶失活。灭活后的酶解液在4000 r/min 下离心5 min，上清液中葡萄糖浓度通过生物传感分析仪（SBA-40D，山东省科学院生物研究所）测量。纤维素酶解得率按式（1）计算。

1.4 分析与检测

1.4.1 玉米秸秆三大组分含量分析

玉米秸秆和p-TsOH 预处理后残渣的纤维素（以聚葡萄糖含量计）、半纤维素（以聚木糖、聚阿拉伯糖等聚糖含量之和计）和木质素含量采用美国能源部NREL 方法测定[14-15]。预处理后残渣中纤维素保留率计算见式（2）、木质素保留率计算见式（3）、半纤维素保留率计算见式（4）。

1.4.2 结晶特性分析

预处理前后玉米秸秆的结晶特性使用X射线衍射仪（XRD，D8-ADVANCE，德国布鲁克公司）测量。结晶指数（Crystallinity Index，CrI）由式（5）[16-17]计算。

式中，CrI 为结晶指数，%；I200为2θ=22.5°处的衍射信号强度；Iam为2θ=18°处的衍射信号强度。

1.4.3 微观形貌观察

通过场发射扫描电子显微镜（FESEM，SU500，日本日立公司）观察预处理前后玉米秸秆的表面微观形貌：取少量冷冻干燥后样品贴在导电胶上，经过高真空离子溅射仪（Q150T ES，英国Quorum Technologies Ltd）喷涂铂金后测试。

1.4.4 表面组成成分分析

预处理前后玉米秸秆的表面组成与其酶解性能紧密相关，测试样品经过丙酮抽提后，通过X射线光电子能谱仪（XPS，Axis Ultra DLD，英国Kratos 公司）分析其表面组成。表面木质素含量由式（6）计算[18]。

式中，φ木质素为表面木质素含量，%；(O/C)抽提为丙酮抽提后的O/C 比；(O/C)碳水化合物为碳水化合物的O/C 比，为0.833；(O/C)木质素为木质素的O/C 比，为0.333。

2 结果与讨论

2.1 p-TsOH预处理玉米秸秆残渣组分含量分析

不同预处理工艺后玉米秸秆残渣的三大组分含量见表1。由表1 可知，p-TsOH 预处理对玉米秸秆三大组分影响较大：当p-TsOH 质量分数、水解温度和水解时间3个因素其中之一不断增大时，预处理后残渣中半纤维素含量和木质素含量均随之降低；纤维素含量则不断增加。木质素含量从初始18.9%下降至最低3.4%，半纤维素含量从初始21.6%下降至最低6.6%，纤维素含量从初始40.5%增至最高77.4%。

表1 p-TsOH预处理玉米秸秆后残渣的三大组分含量Table 1 Content of three main components of p-TSOH hydrolyzed cornstalk residues

随着p-TsOH 质量分数的增加，木质素和半纤维素保留率逐渐降低，在p-TsOH 质量分数为70%时，木质素和半纤维素的保留率分别为7.7%和18.0%，这与前人的研究结果一致[19]。这可能是因为随着p-TsOH 质量分数增加，其对半纤维素的降解作用加强。同时由于p-TsOH 具有表面活性剂的结构特性，形成了大量胶束使得木质素的溶解度增加[6]。其中，木质素保留率在p-TsOH 质量分数为50%时出现转折。p-TsOH 质量分数从10%增加至50%，木质素保留率快速降低，p-TsOH 质量分数从50%增加至70%，木质素保留率的降低变得平缓。这说明当p-TsOH 质量分数超过50%后，继续增加p-TsOH 质量分数对木质素脱除率的提高效率降低。因此，选择p-TsOH 质量分数50%较为适宜。随着预处理p-TsOH 质量分数增加，纤维素保留率基本保持不变，在81%左右波动。这说明p-TsOH 质量分数对纤维素的降解没有明显影响，这有利于预处理过程中纤维素组分的保留。

随着水解时间从20 min增加至100 min，纤维素、半纤维素和木质素保留率变化均不大，分别在82%、23%和14%左右波动。这可能是因为p-TsOH 对非木质纤维素的水解反应速率较快，在较短的处理时间内即可完成主要水解反应。

水解温度对木质素和半纤维素保留率的影响较大，而对纤维素保留率的影响较小。当水解温度从35℃升至95℃时，木质素和半纤维素保留率分别降低至10.0%和13.0%，纤维素保留率为81.0%，这说明水解温度对木质素和半纤维素的脱除作用较明显，而对纤维素的降解作用较为有限。尽管升高温度会降解部分纤维素，但可以较大程度脱除半纤维素和木质素。然而，若将水解温度提高至100℃以上，则会超过溶液的沸点，需要使用压力容器，同时能耗更高。因此，综合考虑预处理效率、成本及安全性，采用最高水解温度95℃较为适宜。

进一步通过SIMCA软件[20]系统分析了预处理因素对玉米秸秆中木质素和半纤维素脱除的影响，拟合分析结果如表2 所示。3 个因素对木质素和半纤维素的解释系数（＞0.85）和预测系数（＞0.5）都较高，说明拟合得到模型的解释和预测能力均较好。同时，拟合过多变量后预测系数开始下降，说明继续增加拟合变量可能会造成过拟合。当变量对因变量的重要性大于1时，则说明其对因变量的影响是显著的。可得出p-TsOH 质量分数和水解温度对木质素的脱除有显著影响，水解温度对半纤维素的脱除有显著影响（见表2）。最终得到预处理后残渣中木质素含量（Lresidue）和预处理后半纤维素的含量（Hresidue）的回归方程分别见式（7）和式（8）。

表2 3因素对木质素和半纤维素的偏最小二乘法拟合分析结果Table 2 Results of partial least squares fitting analysis of 3 factors on lignin and hemicellulose

式中，Lresidue为预处理后残渣中木质素的含量，%；Hresidue为预处理后半纤维素的含量，%；P为p-TsOH质量分数，%；T为水解温度，℃；t为水解时间，min。

综合分析可知，p-TsOH 预处理可以同时脱除玉米秸秆中的木质素和半纤维素，而对纤维素组分的水解作用较弱（纤维素保留率大于80%）（见表1）。SIMCA 软件分析结果可以解释部分信息并可以作为经验公式来预测实验结果，但此分析较为简单并且对于木质素和半纤维素在预处理过程中的降解和迁移过程不能给出很好的解释。因此，进一步通过两相模型，并引入CDF 和CHF 来研究p-TsOH 预处理过程中玉米秸秆木质素和半纤维素的水解脱除过程。

2.2 p-TsOH 预处理玉米秸秆中木质素和半纤维素脱

除动力学

为了研究预处理玉米秸秆中木质素和半纤维素脱除过程，基于前人研究结果，采用CDF 和CHF 来表述3个预处理因素对木质素脱除和半纤维素脱除过程的影响。

CDF计算见式（9）。

LR计算见式（10）。

CHF计算见式（11）。

HR计算见式（12）。

式中，LR为木质素保留率，HR为半纤维素保留率；θ和θ′分别为预处理过程中容易脱除的木质素和半纤维素占比；θR和θ′R分别为预处理中不易脱除的木质素占比和半纤维素占比；f为木质素脱除快反应与慢反应的速率常数之比，f′为半纤维素脱除快反应与慢反应的速率常数之比；C为p-TsOH 的摩尔浓度，mol/L；t为水解时间，min；R 为气体常数，8.314 J/(mol·K)；T为水解温度，K；α、α′、β和β′为可调参数；E和E′分别为木质素脱除反应和半纤维素脱除反应的表观活化能，J/mol。

将表1 的实验数据代入上述模型中，求解得到各参数值见表3。结果表明，p-TsOH 预处理玉米秸秆中较难脱除的木质素和半纤维素的比例较小（均小于25%）；木质素脱除反应活化能为66.5 kJ/mol，半纤维素脱除反应活化能为50.5 kJ/mol，这也说明p-TsOH 预处理玉米秸秆的反应速率较快，且容易受到温度影响。

表3 木质素和半纤维素脱除的拟合参数值Table 3 Fitting parameters of the removal of lignin and hemicellulose

最终拟合得到预处理后残渣中木质素脱除的动力学方程见式（13）和式（14）。

预处理后残渣中半纤维素脱除的动力学方程见式（15）和式（16）。

玉米秸秆预处理后残渣中木质素保留率的实测值与理论值随CDF 的变化一致，说明拟合得到的p-TsOH 预处理玉米秸秆的木质素脱除模型较好（R2为0.9342，见图1（a））。木质素保留率随CDF 的增大，表现为先迅速下降后缓慢下降；曲线在CDF 值为1500 min·mol/L 处出现转折，0～1500 min·mol/L 属于快速脱木质素阶段；1500～15000 min·mol/L 属于慢反应阶段。

图1 p-TsOH预处理玉米秸秆的CDF和CHF曲线Fig.1 CDF and CHF curves of cornstalk pretreated by p-TsOH

玉米秸秆预处理后残渣中半纤维素保留率的实测值与理论值CHF 的变化一致，说明拟合得到的p-TsOH 预处理玉米秸秆的半纤维素脱除模型较好（R2为0.9027，见图1（b））。半纤维素保留率随CHF的增大，也呈现出先迅速下降后缓慢下降的趋势。曲线在CHF 为100 min·mol/L 附近出现转折，当CHF＜100 min·mol/L 时，半纤维素的保留率＞33%，CHF＞300 min·mol/L时，半纤维素的保留率＜23%。

2.3 预处理后玉米秸秆表面微观形貌和结晶性能分析

为了考察p-TsOH 预处理对玉米秸秆表面破坏情况，通过SEM 观察了玉米秸秆和两种p-TsOH 水解工艺（P50T65t40、P50T95t40）处理后残渣的表面微观形貌（见图2）。由图2 可知，玉米秸秆表面较光滑，结构较为致密。通过温和条件（P50T65t40，CDF=947 min·mol/L）预处理后，原料结构被打开，纤维开始初步解聚，表面被破坏并出现孔洞结构。在较为剧烈条件（P50T95t40，CDF=6513 min·mol/L）处理后，原料结构被严重破坏，原料解离为小的纤维束，纤维表面变得粗糙。这说明随着预处理条件的加剧，非木质纤维原料的致密结构被破坏而变得松散，更多的纤维得以暴露，这些都有利于后续酶的接触和吸附。

图2 玉米秸秆经不同预处理工艺的FESEM图Fig.2 FESEM images of cornstalk by different pretreatment conditions

生物质的结晶指数对酶解有重要的影响[21]。玉米秸秆的结晶指数为45.93%，p-TsOH 预处理后玉米秸秆残渣的结晶指数均有所提高（见图3）。这主要归因于p-TsOH 对半纤维素和木质素的脱除。随着p-TsOH 质量分数升高，预处理后残渣的结晶指数有小幅的升高，在p-TsOH 质量分数为70%时，结晶指数为68.91%。随着水解时间增加，预处理后玉米秸秆残渣的结晶指数没有明显变化。随着水解温度的升高，预处理后玉米秸秆残渣的结晶指数有明显提高（在95℃时结晶指数为66.85%）。P10T80t60 预处理条件处理后残渣的结晶指数为62.86%，这说明在较高的水解温度、低p-TsOH 质量分数预处理条件下，预处理后玉米秸秆残渣的结晶指数会有较大程度的升高。

图3 玉米秸秆经不同预处理工艺的XRD图Fig.3 XRD diagram of cornstalk by different pretreatment conditions

2.4 预处理后玉米秸秆的表面组成

生物质的表面组成与其酶解可及性有密切联系，其中表面木质素含量影响纤维素酶在物料表面的结合，进而影响酶解性能[22-23]。通过XPS测定了玉米秸秆和两种p-TsOH 预处理工艺（P50T65t40、P50T95t40）处理后玉米秸秆残渣的表面组成（见图4）。

生物质物料表面的碳化学键可以分为4 种类型（C1、C2、C3、C4）[24]，其中C1 对应于C—C 和C—H 键，主要对应于木质素[24]；C2 对应于C—O，主要对应于纤维素[24]。玉米秸秆C1 峰较强，对应峰面积占比为54.8%，而C2 峰相对较弱，其峰面积占比为36.8%（见图4（a）），说明玉米秸秆表面木质素含量较高，纤维素含量较低。随着预处理条件加剧，C1峰逐渐减小，C2峰逐渐增强，P50T95t40预处理后残渣的C1 峰面积占比为35.7%，C2 峰面积占比为50.7%，说明经过预处理后玉米秸秆残渣表面木质素含量降低（见图4（c））。

图4 玉米秸秆经不同预处理工艺的C分峰谱图Fig.4 Deconvolution of C spectra of cornstalk by different pretreatment conditions

经计算玉米秸秆中表面木质素含量为81.87%，经过p-TsOH 预处理后表面木质素含量降低，经温和预处理工艺（P50T65t40，CDF=947 min·mol/L）处理后玉米秸秆残渣表面木质素含量为66.6%，经较为剧烈预处理工艺（P50T95t40，CDF=6513 min·mol/L）处理后玉米秸秆残渣表面木质素含量为38.6%。随着预处理程度的增加，表面木质素含量迅速减少，这有利于后续酶对纤维素的有效吸附。

2.5 p-TsOH预处理后玉米秸秆残渣的酶解可及性

玉米秸秆水解残渣的酶解糖化是实现木质纤维分级转化高效利用的重要途径[25]。未处理玉米秸秆的酶解得率较低，仅为26.6%（见图5（b）），而p-TsOH 预处理后玉米秸秆残渣酶解得率均有大幅度提高，这说明p-TsOH预处理是提高玉米秸秆酶解得率的有效方法。

图5 p-TsOH质量分数、水解时间和水解温度对预处理后玉米秸秆残渣酶解得率的影响Fig.5 Effects of p-TsOH mass fraction,hydrolysis time and hydrolysis temperature on the enzymatic yield of hydrolyzed cornstalk residual

酶解得率随预处理p-TsOH 质量分数的增加而增加（见图5（a））：p-TsOH 质量分数从10%增加至30%，玉米秸秆残渣酶解得率增加缓慢；p-TsOH 质量分数从30%增加至50%，玉米秸秆残渣酶解得率增加较快；p-TsOH 质量分数从50%增加至70%，玉米秸秆残渣酶解得率增加变缓。在p-TsOH 质量分数为70%时，酶解得率为71.9%。这是由于随着p-TsOH 质量分数的增加，p-TsOH 对非木质纤维的破坏作用增强，更多的纤维素得以暴露，有利于纤维素与酶的接触。低的p-TsOH 质量分数对木质素脱除作用较为有限，而过高的p-TsOH 质量分数对设备腐蚀作用较大，同时高的p-TsOH 质量分数预处理后水解液中溶解的木质素在分离时需要消耗更多的水。因此，选择p-TsOH质量分数50%进行后续酶解实验。

延长预处理水解时间，酶解得率变化不大，保持在63%左右，这与水解时间对木质素脱除效果结果一致（见表1）。提高水解温度，玉米秸秆残渣的酶解得率增加明显，从35℃时的34.9%增加至95℃时的72.9%。这可能是因为水解温度升高，木质素保留率减少。由图5（a）和图5（c）可知，继续增加p-TsOH 质量分数或提高水解温度，酶解得率可以进一步提升。

3 结 论

本研究利用对甲基苯磺酸（p-TsOH）对玉米秸秆进行预处理，研究了3个预处理因素（p-TsOH质量分数（P）、水解温度T和水解时间t）对玉米秸秆三大组分分离的影响以及预处理后残渣的酶解特性，较好地拟合得到了p-TsOH预处理玉米秸秆木质素脱除和半纤维素脱除动力学模型。

3.1 p-TsOH 质量分数和水解温度对木质素的脱除有显著影响，水解温度对半纤维素的脱除有显著影响。拟合得到预处理后残渣中木质素含量和预处理后半纤维素的含量的经验公式如下。

3.2 木质素脱除反应和半纤维素脱除反应的表观活化能分别为66.5 kJ/mol和50.5 kJ/mol。

3.3 p-TsOH 对玉米秸秆较优的预处理工艺为：p-TsOH 质量分数50%、水解温度95℃、水解时间40 min，在此工艺条件下，玉米秸秆残渣的表面木质素含量为38.6%，酶解得率为72.9%。