烟叶中β-胡萝卜素高效降解菌株的筛选鉴定及发酵条件优化

龙章德，王敏，薛云，孙建生，刘启斌，刘鸿，毛多斌，魏涛

1.广西中烟有限责任公司 技术中心，广西 南宁 530001；2.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001

0 引言

类胡萝卜素是存在于植物和微生物中的亲脂性异戊二烯类色素，已知有700多种，主要包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素等，其中β-胡萝卜素分布最广[1-3]。β-胡萝卜素因含有3～15个共轭双键而表现出高度不饱和性，通过酶或光氧化可降解产生C-13、C-11、C-10、C-9等衍生物，这些衍生物中包括α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等重要的香料物质，因此β-胡萝卜素及其降解产物在食品、化妆品、酒类风味发酵、烟草加工等行业均具有广泛应用[4-5]。β-胡萝卜素裂解产物β-紫罗兰酮和β-大马酮是西红柿的主要风味成分[6]；β-胡萝卜素降解形成的类异戊二烯的 C-10化合物组分对柑橘果汁的香气影响很大[7]；葡萄酒主要香气成分异戊二烯衍生物(如β-突厥烯酮、β-紫罗兰酮等)也是β-胡萝卜素降解产物[8]。新鲜烟叶中的类胡萝卜素种类除上文提及的外，还具有新叶黄素、紫黄素、八氢番茄红素等，类胡萝卜素总含量不高，一般为0.1%～1.1%，将β-胡萝卜素添加到烟丝中能有效提高卷烟香味品质[9-10]。

目前β-胡萝卜素的降解方式有物理降解、化学降解和生物降解[11-12]。物理降解需要进行高温处理，不便应用于实际生产；化学降解需要加入化学试剂催化裂解，化学试剂难以去除，且产生的废液会污染环境[4-5]。生物降解是利用微生物及其所产生的酶催化降解β-胡萝卜素，具有降解专一性强、效率高、反应条件温和等特点，但是目前已报道的能降解β-胡萝卜素的微生物还比较少，主要是酵母菌、芽孢杆菌和巴氏葡萄球菌等，能应用到工业生产中的菌株更少[13-15]。

豫烟13是近年来培育的烤烟纯系新品种，烤后原烟颜色均匀、结构疏松、油分较足、化学成分协调，在我国黄淮烟区和东北部分烟区种植较为广泛。本研究拟从豫烟13烟叶中筛选能够降解β-胡萝卜素的新型微生物菌种，通过单因素试验和正交试验对其发酵条件进行优化以提高菌株降解β-胡萝卜素的能力，以期为工业化降解β-胡萝卜素提供新的菌种资源和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料：三门峡烟区种植的新鲜豫烟13烟叶，自行采集得到。

主要试剂：β-胡萝卜素(纯度96%)，购于上海麦克林生化科技有限公司；蔗糖、酵母粉、磷酸氢二钾、硝酸钠，均为分析纯，购于国药集团有限公司。

富集培养基[14]：K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，硝酸钠 3 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L。

发酵培养基和分离培养基：在富集培养基的基础上添加质量浓度为20 mg/L的β-胡萝卜素。

主要仪器：SW-CJ-IF型单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司产；LDZX-50KBS 型立体压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产；UV-1500紫外分光光度计，上海美析仪器有限公司产；5810R型离心机，德国Eppendorf公司产；7890C型GC-MS色谱联用仪，美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株筛选初筛：称取10 g烟叶于100 mL无菌水中浸泡24 h，取2 mL加入到富集培养基中，于30 ℃、150 r/min条件下培养得到菌源液。对菌源液进行稀释涂布，每个浓度梯度涂布3个平行平板，以添加β-胡萝卜素空白平板为对照，置于30 ℃条件下培养，每隔12 h观察平板褪色情况，挑选透明圈明显的、形态较好的单菌落，反复划线分离纯化。

复筛：挑选出透明圈明显的单菌落接种于发酵培养基中，于30 ℃、150 r/min条件下发酵。通过对发酵液中β-胡萝卜素降解率和降解产物的分析筛选出降解β-胡萝卜素能力较强的菌株。

β-胡萝卜素降解率的测定方法：β-胡萝卜素降解率的测定采用分光光度法。以接种的发酵培养基作为实验组，未接种的发酵培养基作为对照组，发酵12 h后分别以培养基作为空白测定实验组和对照组的吸光度，降解率(R)计算公式[17]如下。

式中：C实验为实验组中β-胡萝卜素的质量浓度/(μg·mL-1)；C对照为对照组中β-胡萝卜素的质量浓度/(μg·mL-1)。

β-胡萝卜素降解产物检测方法：用GC-MS对发酵液中的β-胡萝卜素降解产物进行检测。GC检测条件[16]为HP-5柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；高纯氦气作载气，流速为1 mL/min；程序升温：40 ℃，保持2.5 min，以2 ℃/min 的升温速度升至280 ℃并保持5 min；进样量为1 μL；不分流；采用全扫描模式。MS检测条件为溶剂延迟时间8 min；质量扫描范围30～500 amu；进样口温度250 ℃；传输线温度280 ℃；离子源EI温度230 ℃，电离能70 eV；检测器温度280 ℃；全离子扫描(Scan)模式。

1.2.2 菌株鉴定将筛选出的菌株用结晶紫染色2分钟，分别在低倍镜、高倍镜和油镜下观察菌株菌落特征与形态。然后利用16S rDNA鉴定方法进行分子生物学鉴定。提取细菌核基因组DNA，并以提取的DNA为模板，进行16S rDNA扩增，所用引物为27F(正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(反向引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增反应体系为：1.0 μL基因组DNA(20 ng/μL)、39.0 μL ddH2O、5.0 μL 10×Buffer(含2.5 mmol/L Mg2+)，1.0 μL Taq 聚合酶(5 U/μL)，1.0 μL dNTP(10 mmol/L)，1.5 μL 27F引物(10 μmol/L)，1.5 μL 1492R引物(10 μmol/L)。测序由上海派森诺生物科技有限公司完成。用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，得到与待测菌株序列相似性最大的物种信息，以16S rDNA同源性为基础，利用MEGA7.0软件进行系统分析。

1.2.3 菌株发酵条件优化单因素试验：在前期实验的基础上，分别以碳源(蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、葡萄糖)、碳源质量浓度(10 g/L、30 g/L、50 g/L、70 g/L、90 g/L)、氮源(胰蛋白胨、硝酸钠、(NH4)2SO4、尿素)、氮源质量浓度(1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L)、酵母粉质量浓度(1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L)、初始pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、温度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、接种量(1%、3%、5%、7%、9%)为考查因素，研究单因素试验条件下β-胡萝卜素的降解率。

正交试验：在单因素试验的基础上，以β-胡萝卜素降解率为考查指标，利用发酵培养基中适宜碳源的质量浓度(A)、适宜氮源的质量浓度(B)、酵母粉质量浓度(C)和初始pH值(D)4个因素设计L9(34)正交试验。

数据处理：采用Excel 2016对实验数据进行统计分析，利用SPSS 17.0进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选结果

从烟叶中筛选到9株能降解β-胡萝卜素的菌株，其中菌株YT-3降解能力最强，β-胡萝卜素降解率为81.65%(如图1所示)。用GC-MS检测菌株YT-3发酵液，分析出发酵液中含有醛类、酮类、醇类、烯烃类、有机酸和酯类等多种化合物，β-胡萝卜素降解产物主要香味物质如表1所示，其中β-环柠檬醛(3.21%)、β-紫罗兰酮(5.35%)和二氢猕猴桃内酯(12.26%)在改善烟叶品质和制备食品香料方面具有重要作用。因此，进一步对菌株YT-3的β-胡萝卜素降解能力进行研究。

表1 菌株YT-3降解产物主要香味物质

图1 9株降解β-胡萝卜素菌株降解率比较

2.2 菌株鉴定结果

2.2.1 菌株YT-3的菌落特征与形态在固体培养基上划线培养菌株YT-3，其形态特征为菌落较小，色白，表面光滑，湿润，边缘整齐，不易挑起。经革兰氏染色在显微镜下观察，菌体形态为短杆状，菌体呈红色，是革兰氏阴性(G-)菌(如图2所示)。

图2 菌株YT-3的菌落和细胞形态

2.2.2 菌株YT-3分子进化树分析结果由分子鉴定结果可知，菌株YT-3的16S rDNA序列长度为1421 bp(如图3所示,图中1—3为16S rDNA,Maker为DNA分子量标准)。将该16S rDNA序列在NCBI Blast同源序列检索，结果表明，该菌株与霍氏肠杆菌亚种16S rDNA基因序列同源性较高。菌株YT-3系统进化树如图4所示。由图4可知，菌株YT-3与Enterobacterhormaecheisubsp.xiangfangensisstrain 10-17遗传距离较近，结合形态学结果,将YT-3菌株鉴定为霍氏肠杆菌亚种。目前，霍氏肠杆菌EnterobacterhormaecheiA20已被发现可以有效将叶黄素降解为8-甲基-α-紫罗酮、3-羟基-α-紫罗酮、3-氧代-α-紫罗兰酮等[18-19]。菌株YT-3是发现的另一株能够类降解胡萝卜素物质(β-胡萝卜素)的霍氏肠杆菌亚种。

图3 菌株YT-3 PCR扩增电泳图

图4 菌株YT-3系统进化树

2.3 菌株发酵条件优化结果

2.3.1 单因素试验结果碳源种类和质量浓度对菌株YT-3的β-胡萝卜素降解率和细胞干重的影响如图5所示。由图5可知，菌株YT-3在不同碳源下降解β-胡萝卜素的活性为蔗糖>麦芽糖>葡萄糖>乳糖>果糖，以蔗糖为碳源β-胡萝卜素降解率最高，达到82.5%，菌株的细胞干重为1.18 g/L。蔗糖是一种非还原性的双糖，既能为菌株的生长提供足够碳源和能源物质，又能保证菌株YT-3高效降解β-胡萝卜素底物。当蔗糖质量浓度为30 g/L时，β-胡萝卜素降解率达到82.90%，菌株能正常繁殖生长且完全降解底物。因此，初步选择30 g/L蔗糖作为发酵培养基的碳源。

图5 碳源对菌株YT-3的β-胡萝卜素降解率和细胞干重的影响

氮源种类和质量浓度对菌株YT-3的β-胡萝卜素降解率和细胞干重的影响如图6所示。由图6可知，以硝酸钠为氮源时，菌株YT-3对β-胡萝卜素的降解能力最大，降解率为84.9%。硝酸钠质量浓度为3 g/L时，降解率最高为87.7%，菌株的细胞干重为1.66 g/L。氮源质量浓度过高，会使菌体生长过于旺盛，pH值偏高，不利于代谢相关酶的产生和活力保持。因此，初步选择3 g/L硝酸钠作为发酵培养基的氮源。

图6 氮源对菌株YT-3的β-胡萝卜素降解率和细胞干重的影响

酵母粉质量浓度、初始pH值、培养温度和接种量对β-胡萝卜素降解率和菌株细胞干重的影响如图7所示。由图7a)可知，酵母粉质量浓度对β-胡萝卜素降解率影响较大。当酵母粉质量浓度为3 g/L时，既能保证菌株YT-3快速生长，又能提高β-胡萝卜素降解率，降解率最大达到88.3%；当酵母粉质量浓度为9 g/L时，菌株生长状况最好，但是对β-胡萝卜素的降解能力最低。因此，初步选择酵母粉浓度为3 g/L。由图7b)可知，在初始pH值<7.0时，随着pH值增大，β-胡萝卜素降解率随之增大；pH值>7.0时，降解率逐渐降低；pH值为7.0时，降解率达到最高，为89.1%，菌株的细胞干重也最高，为1.33 g/L。因此，初步选择发酵初始pH值为7.0。由图7c)可知，培养温度小于30 ℃时，随着温度升高，菌株新陈代谢加快，降解率提高；温度为30 ℃时，降解率最大，为89.6%，菌株的细胞干重较高，为1.20 g/L；温度大于30 ℃时，菌株生长繁殖受到一定影响，降解率呈下降趋势，但在30～40 ℃时，降解率增大，可能是因为β-胡萝卜素受高温影响发生热裂解[5-6]。因此，温度过高或过低都不利于β-胡萝卜素降解。可见，选择最适培养温度为30 ℃。由图7 d)可知，接种量小于5%时，培养基中的营养物质得到有效利用，菌株能够良好生长，降解率随接种量增加而提高；接种量为5%时，降解率达到最大为89.9%，菌株的细胞干重亦达到较高值，为1.39 g/L；接种量大于5%时，降解率降低，可能是因为接种量过大导致发酵液供氧不足，造成菌株产酶下降[20]。因此，选择最适接种量为5%。

图7 酵母粉质量浓度、初始pH值、培养温度和接种量对菌株YT-3的β-胡萝卜素降解率和细胞干重的影响

2.3.2 正交试验结果在单因素试验的基础上，以发酵培养基中蔗糖质量浓度(A)、硝酸钠质量浓度(B)、酵母粉质量浓度(C)和初始pH值(D)4个因素设计正交试验，因素水平见表2。菌株YT-3降解β-胡萝卜素发酵条件优化正交试验结果见表3，方差分析见表4。由表3可知，极差R的大小依次为A>B>D>C，这说明各因素对降解的影响顺序是蔗糖质量浓度>硝酸钠质量浓度>初始pH值>酵母粉质量浓度。由表4可知，蔗糖质量浓度、硝酸钠质量浓度、初始pH值对β-胡萝卜素降解率均有极显著影响。由所得数据预测最优发酵条件为A2B3C2D2，即蔗糖质量浓度为30 g/L，硝酸钠质量浓度为4 g/L，酵母粉质量浓度为3 g/L，初始pH值为7.0。在该条件下进行验证实验，β-胡萝卜素降解率为97.05%。

表2 β-胡萝卜素降解条件优化正交试验因素水平表

表3 β-胡萝卜素降解条件优化正交试验结果

表4 正交试验结果方差分析

3 结论

本文从豫烟13烟叶中分离到一株能高效降解β-胡萝卜素的菌株YT-3，将该菌株在含有β-胡萝卜素(20 mg/L)发酵培养基中培养，β-胡萝卜素可被有效降解为β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和β-环柠檬醛等香味物质。根据经典形态学和16 S rDNA系统进化树分析，鉴定该菌株为霍氏肠杆菌亚种(Enterobacterhormaniisubsp.YT-3)。经单因素试验和正交试验优化得到菌株YT-3降解β-胡萝卜素最佳发酵条件为：硝酸钠质量浓度4 g/L、蔗糖质量浓度30 g/L、酵母粉质量浓度3 g/L、初始pH值7.0，在该发酵条件下β-胡萝卜素降解率达到97.05%。本研究可为β-胡萝卜素降解菌株的开发利用提供参考，也可为β-胡萝卜素降解产物在食品、化学领域和香精香料行业中的应用提供技术基础。