人胎球蛋白A在原发性肝癌血清中的表达及临床相关性研究

王 朋,付剑惠,刘琦琦,张新毅,王 慧,郭 莉,孙健淇,崔凌志 (.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院检验科，内蒙古 包头 04030;.包头市肿瘤医院药剂科，内蒙古 包头 04030)

目前原发性肝癌已成为全世界最严重的公共卫生问题之一[1]。肝癌的发病率及病死率均居所有恶性肿瘤的前三位[2-5]。原发性肝癌作为一种高发病率、高病死率且病情隐匿的疾病，对其检测、诊断、治疗及患病机制进行研究具有非常重要的意义[6-7]。

目前，甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是临床上诊断原发性肝癌血清标志物的“金标准”。Collier等[8]的研究表明，AFP水平在20 ng·mL-1为筛查原发性肝癌的临界值，但AFP诊断肝癌的敏感度仅为40%～80%，特异性为49%～91%。这主要是因为AFP的合成需要在特定的细胞周期内，当AFP的基因表达低甲基化时，肝癌表现为AFP阳性；而在转录后翻译前AFP表达调控停止时，则肝癌表现为AFP阴性，这在一定程度上影响了AFP的临床应用。对肿瘤直径小于2 cm的原发性肝癌患者，AFP的敏感度则更低。目前原发性肝癌诊断标志物的研究大多停留在实验室阶段，α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase,AFU)与AFP及B超联合检测，可将肝癌诊断的特异性提高至95%[9-10]。

人胎球蛋白A(α2-Heremans-Schmid glycoprotein,AHSG)全长约为1.5 kb，由A链和B链组成，具有高度的遗传多态性，基因型的不同可导致AHSG转录、表达和分泌水平的不同[11]。有研究表明AHSG具有抑制肿瘤生长的作用，可与肿瘤中的特异性细胞因子结合，抑制结合于细胞表面的受体表达，从而抑制细胞的转化[12-13]。

本研究采用酶联免疫法检测原发性肝癌、肝硬化和其他肝病患者的AHSG水平，探讨AHSG的活性与肝病严重程度的相关性，同时探讨AHSG和AFP联合检测在原发性肝癌中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

TBA120FR全自动生化分析仪，MK3酶标仪，E601化学发光分析仪，ECLIA-IIS化学发光免疫分析仪，湘仪L550离心机，全自动洗板机，振荡器。

1.2 试剂

AFU检测试剂盒、质控品及其校准品均由宁波美康生物科技股份有限公司提供；AHSG及其校准品由厦门研科生物技术有限公司提供；丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase，GGT)检测试剂盒、质控品及其校准品均由贝克曼库尔特公司提供；乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)检测试剂盒及其校准品由美国罗氏诊断公司提供；癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖类抗原125(carcinoembryonic antiten，CA125)、糖类抗原199(carcinoembryonic antiten，CA199)、AFP检测试剂盒及其校准品由北京华科泰生物技术有限公司提供。

1.3 标本收集

收集内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院(简称包医二附院)2016年6月至2019年12月169例肝病住院患者的血清，其中原发性肝癌患者61例，年龄47～67岁，平均(56.9±9.6)岁，男35例，女26例；肝硬化患者63例，年龄18～75岁，平均(58.7±11.0)岁，男39例，女24例；其他肝病(包括肝损伤、肝肿物、肝占位和肝功能异常)患者45例，年龄18～75岁，平均(58.8±13.5)岁，男30例，女15例。原发性肝癌的诊断参照2011年版《原发性肝癌诊疗规范》，肝硬化的诊断结合肝活检、影像学检查及实验室检查等。采集包医二附院同期30例体检中心健康人员的血清作为对照组。排除标准：①合并严重的心、肺、肾疾病；②合并免疫性疾病、严重感染性疾病、血液病、内分泌系统疾病及其他恶性肿瘤；③妊娠；④酒精性肝病和丙型肝炎病毒引起的肝病。

1.4 酶联免疫法检测AHSG活性

将AHSG检测试剂盒从冰箱取出，室温放置30 min，设置校准品孔和待测样本孔，分别加入AHSG校准品和待测样本100 μL，混匀后盖上板贴，37 ℃温育 2 h。弃去孔内液体，甩干，不必洗板。每孔加入生物素标记抗体工作液100 μL，盖上新板贴，37 ℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，使用自动洗板机洗板3次，扣干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，盖上新板贴，37 ℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，再使用自动洗板机洗板5次，扣干。每孔依次加入底物溶液90 μL，37 ℃避光显色5 min；每孔依次加入终止溶液50 μL，终止反应。在酶标仪450 nm波长处依次测量各孔的光密度(OD)值。

1.5 化学发光法检测AFP活性

AFP检测试剂盒内取出包被板，分别加入25 μL的AFP校准品和待测样品，再分别向孔内加入150 μL标记物，充分震荡后，37 ℃温育30 min，用稀释后的洗涤液洗板5次，最后将包被板在干净的滤纸上扣干。再分别加入发光底物100 μL，瞬时震荡后立即检测。

1.6 其他项目的检测

采用全自动生化分析仪检测AFU、ALT、GGT、AST、ALP水平。采用化学发光法检测CEA、CA125、CA199、HBsAg水平。

1.7 标准曲线的绘制

校准品以6 000 r/min离心30 s，用1 mL样本稀释液溶解，放置备用。取7个1.5 mL离心管依次排列，各加入250 μL样本稀释液。吸取250 μL校准品到第1个离心管，再从第1个离心管吸取250 μL到第2个离心管，以此类推进行校准品的倍比稀释。将校准品减去空白孔数值后绘制曲线，以校准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘制出标准曲线。

1.8 Child-Pugh评分评估肝功能分级

根据患者的基线信息，结合肝性脑病、腹水、凝血酶原时间、血清白蛋白及血清总胆红素5个指标计算Child-Pugh评分，其中每项1～3分，将5个指标得分相加。根据Child-Pugh评分进行分级，分级标准：A级为5～6分；B级为7～9分；C级为10～15分。

1.9 统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 20 统计学软件进行数据分析。AHSG水平与患者Child-Pugh分级的相关性采用Pearson分析；各组检测数据偏态分布用中位数(四分位数间距)[M(P25～P75)]表示，采用Mann-WhitneyU检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义；多组间比较采用单因素方差分析；计算每个指标单独及联合诊断的ROC曲线下面积(areaunderthecurve,AUC)用于诊断效能的评价；以Youden指数最大时为最佳Cut-off值，计算敏感度和特异性。

2 结果

2.1 不同Child-Pugh分级患者AHSG水平比较

Child-Pugh分级结果显示，61例肝癌患者中，A级有40例(65.6%)，B级有20例(32.8%)，C级有1例(1.6%)；63例肝硬化患者中，A级有41例(65.1%)，B级有22例(34.9%)；45例其他肝病患者中，A级有36例(80.0%)，B级有9例(20.0%)。其中肝癌组Child-Pugh分级B级患者的AHSG水平高于A级，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 不同Child-Pugh分级患者AHSG水平比较(ng·mL-1)

2.2 各组实验室检测结果比较

肝癌组的AHSG、AFP、CEA水平高于肝硬化组、其他肝病组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；肝癌组的AST、GGT和ALP水平均高于肝硬化组，差异均有统计学意义(P<0.05)；肝硬化组的AFP、ALT、AST、GGT、ALP水平低于其他肝病组，差异均有统计学意义(P<0.05)；肝硬化组的AHSG、AFU、CA199、CA125、AST、ALP水平高于对照组，AFP水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；肝癌组与肝硬化组的AFU、CA199、CA125、ALT水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；肝硬化组和其他肝病组的AHSG、AFU、CEA、CA199、CA125水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组实验室检测结果比较[M(P25～P75)]

2.3 AHSG诊断原发性肝癌的分析

肝癌组AHSG的平均水平(中位数)明显高于肝硬化组、其他肝病组和对照组，肝癌组AHSG的波动程度也比其他3组要大(图1)。ROC曲线结果显示，AHSG、AFP、AFU和CEA单独检测的AUC(95%CI)分别是0.707(0.618～0.797)、0.885(0.824～0.946)、0.649(0.618～0.797)、0.675(0.588～0.763)，P值分别是0.000、0.000、0.001、0.000，AHSG和AFP联合检测的AUC(95%CI)是0.900(0.845～0.955)，P=0.000，AHSG、AFP、AFU三者联合检测的AUC(95%CI)是0.900(0.845～0.955)，P=0.000，而AHSG、AFP、AFU、CEA联合检测的AUC(95%CI)是0.906(0.853～0.960)，P=0.000，见图2。

*:提示极端值，在AHSG试剂盒检测线性范围内图1 各组AHSG水平比较

图2 AHSG诊断原发性肝癌的ROC曲线分析

2.4 AHSG、AFP、AFU和CEA单独及联合检测诊断原发性肝癌

以原发性肝癌诊断作为因变量，将AHSG、AFP、AFU和CEA作为连续型变量进行多因素Logistic回归分析，以Youden指数最大时为最佳Cut-off值，每个单独检测项目取3个浓度进行敏感度和特异性的比较。结果显示单独使用AHSG作为诊断原发性肝癌标志物的最佳Cut-off值为100 ng·mL-1，敏感度达60.7%，特异性达81.5%；单独使用AFP作为诊断原发性肝癌标志物的最佳Cut-off值为10 ng·mL-1，敏感度达80.3%，特异性达89.9%；AHSG和AFP联合检测诊断原发性肝癌的敏感度达80.3%，特异性达90.8%；AHSG、AFP、AFU三者联合检测及AHSG、AFP、AFU、CEA四者联合检测诊断原发性肝癌的敏感度均为80.3%，特异性均为90.8%，见表3。因此，AHSG和AFP联合检测用于诊断原发性肝癌明显优于4个项目的单独检测[0.900(95%CI:0.845～0.955)]。

表3 诊断原发性肝癌的4个检测项目Cut-off值、敏感度和特异性比较

3 讨论

原发性肝癌是一种发病隐匿、恶性程度高的恶性肿瘤，其无特异性的症状或体征；超过50%的原发性肝癌患者在初次就诊时就己进入中晚期，失去根治性治疗的机会，只有少数的患者能够在早期诊断。诊断原发性肝癌的肿瘤标记物较多，但缺乏诊断敏感度和特异性都较高的标志物，需多个项目联合检测以弥补单个检测项目敏感度或特异性低的缺陷。原发性肝癌筛查和辅助诊断最常用的血清学标志物包括AFP、AFU和CEA，其中AFP诊断的专一性仅次于病理检查[14-15]。已有文献报道，当AFP临界值为20 ng·mL-1时，AFP诊断肝癌的敏感度达65%，特异性达94%，但AFP用于原发性肝癌早期诊断的假阴性率很高，在45%左右，当肝癌进展到晚期时，AFP表达量超过检测线性范围，也会出现假阴性，这会对临床医师的诊断造成一定的影响[16]。既往研究表明，在肿瘤患者的血清中常常能够检测出AHSG自身抗体，在肿瘤的生长过程中都会有一个合成AHSG的子集，从而推测AHSG可能是肿瘤生长的最早指标之一[17-18]。因此，本研究将AHSG作为主要标志物，同时选择了3个浓度梯度并分别联合AFP、AFU和CEA对原发性肝癌进行诊断。

本研究评估了AHSG、AFP、AFU和CEA 4种肿瘤标记物在原发性肝癌、肝硬化、其他肝病诊断中的有效性，同时对肿瘤标记物进行单独和联合诊断疾病的敏感度和特异性了分析和比较，结果显示，肝癌组患者的血清AHSG水平明显高于肝硬化组和其他肝病组，表明AHSG对于诊断肝癌具有重要的临床意义。Child-Pugh分级结果显示，肝癌组B级患者的AHSG水平高于A级，C级由于标本数量的限制不作比较，初步提示AHSG水平与肝病的严重程度相关。本研究将AHSG、AFP、AFU和CEA进行单独及联合检测，ROC曲线结果显示，联合检测的AUC显著优于单独检测，因此在原发性肝癌诊断上建立合理的多指标检测模型有利于提高其准确性。

本研究选择了3个浓度梯度并分别联合AFP、AFU和CEA对原发性肝癌进行诊断，Youden指数计算结果显示，AHSG诊断原发性肝癌的最佳Cut-off值是100 ng·mL-1，其敏感度为60.7%，特异性为81.5%；而单独使用AFP作为诊断原发性肝癌标志物的最佳Cut-off值为10 ng·mL-1，敏感度达80.3%，特异性达89.9%，比文献[8]报道的20 ng·mL-1效果好。而肿瘤标记物联合检测结果显示，联合检测的敏感度和特异性优于四项单独检测。在评价AHSG和AFP联合检测，AHSG、AFP、AFU三者联合检测，AHSG、AFP、AEU、CEA四者联合检测的特异性和敏感度发现，肿瘤标记物数量增加过多时特异性和敏感度并无变化，因此在诊断原发性肝癌时并不是联合检测的项目越多，敏感度和特异性越高。然而本研究纳入的原发性肝癌病例相对较少，缺乏随访数据，今后将大量收集随访的临床数据，以更加明确AHSG对原发性肝癌的诊断意义。

综上所述，AHSG在原发性肝癌诊断中是具有重要意义的肿瘤标志物之一，AHSG和AFP联合检测可弥补AFP单独检测的特异性不足问题，进一步提高了对原发性肝癌诊断的特异性。