向日葵副产物微贮复合发酵条件的响应曲面优化分析

李 肖 陈永成 许平珠 张凡凡* 马春晖*

(1.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；2.新疆蓿之花草源生态有限公司，哈巴河 836700)

随着畜牧业高速发展，为缓解人畜争粮问题，新型动物饲料资源的开发利用势在必行。向日葵(Helianthusannuus)为菊科向日葵属的一年生经济类作物，具有抗旱和耐寒的特性，且产量不受纬度、海拔高度和光照周期等的影响[1]，世界范围内均有广泛种植，在我国主要分布在西北、华北和东北地区。目前，新疆地区向日葵种植面积达到140万～150万亩(1亩≈667 m2)[2]，每年产生大量的葵杆和葵盘等向日葵副产物，此类资源多被粉碎还田或直接焚烧，极大地危害了生态环境[3]。如将这些资源加以利用，能够在一定程度上缓解新疆局部地区饲草短缺压力，为该地区畜牧业稳定发展开发新的饲草资源。

向日葵副产物不仅营养丰富，且具有药用价值，若合理利用可作为反刍动物的能量和蛋白质饲料[4]。目前主要通过添加外源添加剂[5-7]或采用混贮的方式[7-9]，以提高向日葵副产物的利用效率，其中添加外源添加剂是最为经济的方式。研究发现，添加发酵剂可改善青贮过程中微生物的发酵效率，促进植物细胞壁的降解，从而改善青贮发酵品质并提高适口性[10]。其中，在类似的秸秆发酵(玉米秸秆、香蕉茎、小麦秸秆等)中添加纤维素酶类制剂，可将植物细胞壁降解为可溶性碳水化合物(WSC)，并使细胞内容物充分释放，促进发酵[11-12]；在青贮玉米和紫花苜蓿青贮中添加尿素均能够增加青贮饲料的粗蛋白质(CP)含量，也可作为乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)生长繁殖的氮源促进乳酸(lactic acid，LA)发酵[13-14]；添加糖蜜能为乳酸菌发酵提供底物，产生的LA能抑制青贮中有害微生物的生长和减少发酵体系营养损失[15]；也有研究表明，在向日葵青贮中添加糖蜜可以显著降低青贮中纤维的含量[16]。但是，目前针对向日葵副产物发酵剂的配方及剂量尚未形成明确定论。

响应曲面优化法(response surface methodology，RSM)通过建立连续变量曲面模型，评价影响生物过程的因子及其交互作用，确定最优工艺参数，是目前解决生产实际问题并降低开发成本最为有效的方法之一[17]。鉴于此，本试验拟采用响应曲面优化法探究糖蜜、纤维素酶、尿素和乳酸菌4种发酵剂复合发酵的最优添加量，为向日葵副产物的高效发酵提供理论基础，并为当地资源的有效利用提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用向日葵副产物(包括葵杆、葵头、葵叶)采自新疆蓿之花草源生态有限公司哈巴河县试验基地(坐标：48°4′50.77″ N，86°23′58.77″E；海拔530 m)，其中葵杆、葵头和葵叶分别占总重的61.3%、21.4%和17.4%[干物质(DM)基础]，将收获后的原料短切至1～2 cm备用。尿素购自乌鲁木齐石化分公司(总氮含量≥46%)；糖蜜购自中粮屯河糖业股份有限公司昌吉糖业分公司，总糖(蔗糖和还原糖)含量≥45%；纤维素酶购自庞博生物公司，酶活性为10 000 U/g，主要成分为纤维素酶和葡萄糖；乳酸菌采用产酸能力较强的植物乳杆菌ACCC11016(LactobacillusplantarumACCC11016)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，ACCC)。

1.2 试验设计

试验采取响应曲面优化法。通过查阅相关文献[11-15,18-19]，初步确定各添加剂的添加量[鲜重(FM)基础]，乳酸菌添加量分别为1×105、5×105和1×106CFU/g，纤维素酶添加量分别为0.05%、0.10%、0.15%，糖蜜添加量分别为2%、3%、4%，尿素添加量分别为0.1%、0.3%、0.5%，所选择的添加量范围能够涵盖各添加剂的最优添加量，进行响应曲面优化分析可进一步得到复合条件的添加量。

将乳酸菌复壮后采用MRS液体培养基(北京陆桥技术股份有限公司)扩繁至目标剂量；然后进行响应曲面优化，设计方法为框贝肯设计(box-Behnken design，BBD)，本试验中以LA和中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)含量为响应值，自变量分别为乳酸菌(A)、糖蜜(B)、尿素(C)和纤维素分解酶(D)添加量，每个自变量的3个试验水平(低、中、高)编码分别为-1、0、1(表1)。微贮采用真空袋法调制(真空带规格为40 cm×50 cm)，每袋定量填装1 kg，将4种发酵剂按照BBD设计的处理进行添加(依照原料基础含水量，将4种添加剂配制至纯净水中，最终使得所有处理发酵体系含水量为72%)，共29个处理，每个处理重复3次，填装后立刻采用抽真空机进行密封，共计87个样品。实验室环境(23～28 ℃)发酵30 d，30 d后开袋分析LA和NDF含量。在相同环境下，向日葵副产物不添加任何发酵剂，进行发酵前后发酵品质分析，共2个处理，每个处理3个重复。

表1 试验因素与编码水平

1.3 指标测定及方法

营养品质测定：向日葵副产物原料自然发酵前后(不做任何处理，仅用蒸馏水调配发酵体系含水量至72%)，分别称200 g于65 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过40目筛并保存备用。样品中的DM含量采用冷冻干燥法检测(DHG-9620A鼓风干燥机，上海合恒仪器设备有限公司)，NDF、酸性洗涤纤维(ADF)含量采用范式洗涤纤维法测定(自制纤维袋，专利号：ZL201621382211.7和ZL201621382214.0)，CP含量采用凯氏定氮法测定(Kjeltec 8400 FOSS全自动凯氏定氮仪，美国福斯公司)，WSC含量采用蒽酮-硫酸比色法测定(722可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司)，粗脂肪(EE)含量采用石油醚浸提法测定(玻璃索氏提取器，上海垒固有限公司)，粗灰分(Ash)含量采用550 ℃灼烧法测定(XL-3000型高效节能智能一体马弗炉，上海合恒仪器设备有限公司)[20]。

开袋后分别将各处理向日葵副产物青贮饲料混匀，准确称取20 g放入250 mL三角瓶中，并加入180 mL蒸馏水后封口，放入4 ℃冰箱浸提24 h后用4层纱布过滤，再用0.45 μm滤膜过滤，LA含量采用高效液相色谱法(HPLC)测定[21]，色谱条件为：Waters Atlantis C18；流动相20 mm磷酸二氢钠(pH为2.7)；流速0.7 mL/min；紫外波长210 nm，柱温30 ℃，样前过膜，测时间为45 min，压力138 bar；进样20 μL；紫外检测器波长214 nm。同时测定各处理NDF含量。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2010软件对数据进行初步整理和统计。不添加发酵剂发酵前后所有指标采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析，差异性比较采用Duncan氏多重比较法。Design Expert 8.0软件进行响应曲面优化分析，拟合的二次多项式模型为：

式中：Y为预测响应值(标注为R)，即LA和NDF含量的预测值；xi和xj为自变量的编码值；n为因子数(n=4)；c0为常数项；ai为线性系数；bij为二次项系数。

采用BBD试验设计方法对二次多项式模型中各试验进行回归拟合，并得到拟合后的回归方程，然后运用软件中自带功能，选取2个预测值R1(NDF含量)最小，R2(LA含量)最大，以此得到最优的各水平编码值，最终计算求得各个变量的最优组合[18]。

2 结果与分析

2.1 向日葵副产物发酵前后营养成分和发酵指标比较

由表2可知，与发酵前相比，发酵后向日葵副产物pH和DM、NDF和WSC含量显著降低(P<0.05)，LA含量显著提高(P<0.05)，而ADF、Ash、CP和EE含量差异不显著(P>0.05)。

表2 向日葵副产物发酵前后营养成分和发酵指标比较

2.2 模型建立及显著性检验分析

由表3可知，按照BBD设计得到的变量代码进行试验，NDF含量在代码0(A)、0(B)、1(C)、-1(D)条件下，测得最大值(39.22%)；在代码0(A)、0(B)、1(C)、1(D)条件下，测得最小值(27.72%)，总体平均值为33.78%，标准差(SD)为1.89，变异系数(CV)为5.58%。LA含量在代码1(A)、1(B)、0(C)、0(D)条件下，测得最大值(9.34%)；在代码0(A)、-1(B)、-1(C)、0(D)条件下，测得最小值(5.68%)，总体平均值为7.16%，SD为0.56，CV为7.88%。

表3 BBD设计及中性洗涤纤维和乳酸含量的实际值

通过Design Expert软件，按照二次多项式模型对表2中R1、R2数据进行多元回归拟合，得到R1和R2对4个编码自变量的二次多项回归方程：R1=33.38-0.92A-2.43B-0.96C-3.08D-1.09AB-1.38AC+0.58AD+1.66BC+1.00BD-2.11CD+5.833E-004A2-0.57B2+3.15C2-1.60D2；R2=7.40+0.57A+0.48B+0.15C+0.029D+0.82AB+0.42AC+0.56AD-0.61BC+0.72BD-0.49CD+0.23A2+0.051B2-0.69C2+0.19D2。

表4 中性洗涤纤维和乳酸含量的回归方程系数及其显著性检验

2.3 复合发酵条件NDF和LA含量的响应曲面分析

通过对R1所绘制的响应曲面图及等高线图可知(图1)，对R1起主要作用的是因素D，在因素D和因素A、因素B和因素C的交互作用中，起主要作用的均为因素D。在因素B和因素A、因素C的交互作用中，对R1起主要作用的为因素B；而因素A和因素C的交互作用对R1的影响不显著(P=0.167)。因素C和因素D的交互作用中，R1趋于最小(27.72%)。总体来看，仅因素C和因素D的交互作用对R1的影响显著(P<0.05)，其余各因素之间的两两交互作用对R1的影响均不显著(P>0.05)(表4)。

通过对R2所绘制的响应曲面图及等高线图可知(图2)，因素A和因素B的交互作用对R1的影响最大，因素A和因素B的代码越接近于1，R2越趋于最大值(9.34%)。对R2起主要作用的是因素A，因素A和其他因素交互作用中也占主导作用。因素B和因素C、因素D的交互作用中起主要作用的为因素B，因素C和因素D的交互作用对R1的影响不显著(P=0.106)。总体来看，除因素A和因素B、因素B和因素C、因素B和因素D的交互作用外，其余各因素之间的两两交互作用对R2的影响均不显著(P>0.05)(表4)。

最终利用软件求出R1为最小值，R2均为最大值的代码解(最优解)：A=0.950，B=0.810，C=0.000，D=0.790，将代码解换算成实际自变量可得，乳酸菌添加量为9.5×105CFU/g，糖蜜添加量为3.81%，尿素添加量为0.3%，纤维素酶添加量为0.14%。将最优解代入二次多项回归方程进行计算，得出R1=26.95(即NDF理论含量为26.95% DM)，其相比未添加发酵剂处理的NDF含量(36.13% DM)降低了9.18% DM(34.06%)；R2=10(即LA理论含量为10% FM)，其相比未添加发酵剂处理的LA含量(4.26% FM)提高了5.74% FM(134.74%)。

R1表示中性洗涤纤维含量；A为乳酸菌添加量代码；B为糖蜜添加量代码；C为尿素添加量代码；D为纤维素酶添加量代码。下图同。

3 讨 论

动物饲粮中NDF含量能影响反刍动物瘤胃正常发酵，在一定程度上能调节反刍动物营养[22]；LA含量则是反映青贮品质的重要指标，能使青贮中pH降低，进而限制其有害微生物的生长，减少发酵体系营养损失，因此本研究主要选择这2项指标进行复合发酵条件的优化。影响青贮品质的指标诸多，本研究之所以选择较为主要的2项指标，客观原因是选取多个指标进行响应曲面优化，其操作性较差，且某些发酵指标在发酵体系中不是严格按照高低水平判断的，例如pH、乙酸含量、挥发性脂肪酸含量等。

3.1 发酵前后向日葵副产物青贮主要营养成分

本研究中，向日葵副产物在青贮30 d后NDF、WSC和DM含量及pH显著降低，LA含量显著提高。在发酵前期，植物表面附着的纤维素分解菌及有害微生物的生长繁殖促进纤维了纤维类物质的分解[23]，降低了WSC含量，并造成了发酵体系中的DM损失[16]，当氧气消耗完后，好氧微生物活动得到抑制，乳酸菌开始迅速繁殖，产生了大量的LA，并使pH下降[24]。此外，发酵后形成的酸性环境也可能会造成纤维的酸解，使NDF和ADF含量下降[25-26]。

R2表示乳酸含量。

3.2 添加发酵剂对NDF含量的影响

3.3 添加发酵剂对LA含量的影响

本研究证实，在确定的4个发酵条件中，对青贮中LA含量影响最主要的因素为乳酸菌添加量，且糖蜜与乳酸菌添加量的交互作用对LA含量的影响也较为显著。在青贮发酵过程中，添加乳酸菌在青贮前期增加了乳酸菌基数，添加糖蜜可作为乳酸菌发酵的底物，促进LA发酵[16]，因此目前国内外发酵剂的主要配方也均以乳酸菌为主。此外，大量研究发现青贮中LA含量与乳酸菌添加剂量成正比[18]，然而当其添加量达到一定剂量时，对LA含量影响会逐渐降低[19]，这主要与乳酸菌属的嗜酸能力及竞争性作用有关。添加尿素对青贮中LA的含量影响不显著，而尿素添加量与糖蜜添加量交作用对LA含量影响显著，尽管添加尿素能抑制青贮中有害微生物(霉菌、酵母菌等)的活性，减少发酵体系中碳水化合物的损耗，但单独添加尿素并不能有效促进LA发酵，而尿素与糖蜜复合添加为青贮中乳酸菌发酵提供氮源与糖源，促进乳酸菌产LA[30]。糖蜜和纤维素酶添加量的交互作用对青贮中LA含量影响显著，主要因为纤维素酶将纤维素降解为单糖，产生的单糖与糖蜜共同为青贮中的乳酸菌提供底物促进LA的生成[31]。

以往对向日葵副产物青贮添加剂添加量优化的研究较少，本研究通过对向日葵副产物青贮中复合添加乳酸菌、尿素、糖蜜和纤维素酶的添加量进行优化，建立适宜的发酵条件，在后期实际生产中需进行进一步验证。

4 结 论

本研究得到向日葵副产物的最佳发酵条件为：乳酸菌添加量为9.3×105CFU/g，糖蜜添加量为3.57%，尿素添加量为0.3%，纤维素酶添加量为0.14%。在此条件下厌氧发酵30 d，理论上可使NDF含量降低34.06%，LA含量提高134.74%。