3种放线菌剂对黄瓜根结线虫病的防治效果

李许真，杨晓沛，苑 鑫，陈书霞

(西北农林科技大学 园艺学院 陕西省蔬菜工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

根结线虫是一种常见的、世界范围内广泛分布的植物寄生线虫，尤其是南方根结线虫，其寄主包括蔬菜、粮食作物、果树、观赏植物等3 000多种，严重危害世界农业生产[1-2]。根结线虫病害可造成作物减产10%～20%，严重时可达75%以上，甚至出现绝收的现象[3]。随着设施栽培的不断发展，保护地栽培的面积越来越大，复种指数增加，重茬现象严重，导致根结线虫的危害日趋严重。据不完全统计，全球根结线虫病害每年造成的经济损失在1 000亿美元以上，中国每年损失大约30亿美元[4]。

长期以来，采用化学农药控制根结线虫取得了很好的效果，但随着化学农药的滥用，病原物产生抗药性以及农药残留造成的环境污染等问题随之产生，人类健康日益受到威胁。生物防治“以菌克菌”，对环境副作用小，在控制植物病害中显示出了一定优势，是一条安全、有效的防治途径[5]。部分放线菌具有稳定、持久和环境友好的作用，在农业生产上广泛应用[6]。阿维菌素就是一种来自阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)的商业生物防治剂，可将蚕豆中由南方根结线虫引起的根结减少50%以上[7]。1.0和1.5 g/株玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活菌片剂对黄瓜根结线虫病的防效分别为51.85%和55.56%[8]。蚯蚓粪便中存在大量放线菌，且48%的放线菌具有控制根结线虫的能力，其中12种链霉菌属分离菌表现出很强的体外杀线虫活性；与对照相比，链霉菌属分离菌处理后的植物根系根结数显著降低，其中链霉菌属KPS-E004的抑制效率最高[9]。链霉菌菌株A034对辣椒根结线虫病有较好的防治效果，该菌株的施用显著减少了土壤中的线虫卵块数量[10]。与接种KPS-E004和KPS-A032单株相比，2种链霉菌菌株联合接种对根结线虫的抑制效率分别提高了104.99%和355.54%，辣椒根系的根结数也显著降低，根结指数显著减小[11]。菌株S.pactum和S.rochei的混合使用也明显减少了番茄幼苗根部的根瘿形成和根结线虫种群密度[12]。

作为营养增强剂，链霉菌剂通过生产侧磷和溶解磷酸盐，将土壤中的复杂营养物质转化为简单的形式，是天然肥料的理想候选物[13]。研究表明，施用链霉菌菌株A034可显著促进辣椒芽和根的生长，增加辣椒总N、P、K、Ca、Mg和Fe含量[10]。使用菌株KPS-E004和KPS-A032的混合物可通过增加辣椒枝条和根的长度和质量，进而增加辣椒产量[13-14]。密旋链霉菌制剂的使用能减少瓜列当的寄生量，促进番茄增产[15]。另外，链霉菌菌株产生的植物激素还具有促进茄子生长、减少茄子根结线虫病的作用[16]。基于DNA的分析表明，在作物栽培期间，链霉菌菌株能够在根结线虫侵扰的土壤中存活和增殖，并且对微生物群落也非常友好[10]。链霉菌菌株的使用是可持续农业发展战略下蔬菜作物生产的有效措施[11]。但目前关于链霉菌菌株缓解黄瓜根结线虫病的效应研究尚未见报道。为此，本研究以黄瓜植株为试验材料，通过预先接种密旋链霉菌(Streptomycespactum)、微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)和娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei)，然后再人工接种南方根结线虫卵的方法，对黄瓜幼苗及槽式栽培黄瓜成株期根系根结数、根结指数及植株生长状态进行分析，以期探究链霉菌剂对黄瓜根结线虫病的影响程度，为黄瓜根结线虫病的环境友好型防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄瓜品种为华北生态型9930，该种质对南方根结线虫表现为感病。

供试放线菌剂密旋链霉菌(Streptomycespactum，Act12)、微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus，T4)和娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei，D74)，均由陕西博秦生物工程有限公司提供，有效菌数≥2×109g-1。

供试南方根结线虫从杨凌园艺场发病严重的日光温室栽培黄瓜根中收集，参考刘维志[17]的方法提取虫卵。用蒸馏水将线虫卵悬浮液调至1 500 mL-1备用。

1.2 试验方法

1.2.1 放线菌剂对黄瓜幼苗根结线虫病的防治 分别将密旋链霉菌(Act12)、微白黄链霉菌(T4)、娄彻氏链霉菌(D74)接入高压灭菌后的基质中，菌剂(g)和基质(L)按1.5 g/L混合,以不接种放线菌剂的高压灭菌基质为对照。黄瓜种子进行温汤浸种，28 ℃培养皿中催芽，种子露白后播种于7 cm×7 cm装有不同处理基质的苗钵中，2粒/钵，待子叶出土后留1株壮苗，定期浇水。黄瓜幼苗的培养条件为26 ℃/18 ℃，14 h/10 h光暗交替，相对湿度为85%～90%。待黄瓜生长至两叶一心(播种30 d)时采用灌根法接种南方根结线虫虫卵，每钵接种1 500 mL-1的线虫卵悬浮液2 mL，各处理依次用Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi和Mi表示。接种线虫卵悬浮液30 d后，小心洗净根系，统计根结数，采用分析天平测定根鲜质量，参考符美英等[18]的方法计算根结指数。每处理10株，3次重复。

根结指数=单株根结数/单株根鲜质量。

1.2.2 放线菌剂对黄瓜成株根结线虫病的防治 为了进一步观察放线菌对黄瓜根结线虫病害的缓解效应，在温室栽培槽内进行放线菌预接试验。试验设置Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi和Mi 4个处理，其中Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi处理先分别将密旋链霉菌(Act12)、微白黄链霉菌(T4)、娄彻氏链霉菌(D74)接入高压灭菌后的基质中，菌剂(g)和基质(L)按1.5 g/L混合，分别倒入温室栽培槽中；Mi处理将不接种放线菌剂的高压灭菌基质倒入温室栽培槽中。黄瓜种子催芽直播，每个栽培槽中9株壮苗作为1个重复，重复3次。待幼苗长至两叶一心时采用灌根法定量接种南方根结线虫虫卵1 500 mL-1悬浮液2 mL。黄瓜植株进行常规管理。接种线虫后58 d，采用与幼苗相同的方法记录根结数，称量根鲜质量，计算根结指数。

1.2.3 放线菌剂对感染根结线虫黄瓜幼苗根系巨细胞的影响 在黄瓜幼苗盆栽试验中，接种南方根结线虫卵悬浮液30 d后，分别取Mi、Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi 4个处理中的5株幼苗根系，挑选每个单株上横径最大的2个根结，每个处理共10个根结，用FAA固定液进行固定，采用苏木精-伊红染色法[19]制作石蜡切片，每个根结样品选取2～3张切片，在Olympus光学显微镜下观察并拍照记录。

1.2.4 放线菌剂对黄瓜生长的影响 1)苗期盆栽试验。试验设Mi、Act12、T4、D74、Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi、CK 8个处理，其中Mi处理仅在黄瓜播种后30 d接种南方根结线虫；Act12、T4、D74处理仅在黄瓜播种前分别预先接种密旋链霉菌、微白黄链霉菌、娄彻氏链霉菌；Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi处理先分别预先接种密旋链霉菌、微白黄链霉菌、娄彻氏链霉菌，再在黄瓜播种后30 d接种南方根结线虫；CK处理既不接种放线菌也不接种南方根结线虫。待幼苗长至两叶一心时采用灌根法定量接种南方根结线虫虫卵1 500 mL-1悬浮液2 mL。接种线虫卵悬浮液30 d后，取各处理长势一致的幼苗各10株，3个重复，小心清洗根系，吸干表面水分，用游标卡尺测定茎粗，然后用分析天平测定地上鲜质量、地下鲜质量和全株鲜质量。最后将洗净的根系放入培养皿中进行拍照，观察根系生长情况。

2)温室槽式栽培成株试验。试验设Mi、Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi 4个处理，其中Mi处理仅在黄瓜播种后30 d接种南方根结线虫；Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi处理先分别预先接种密旋链霉菌、微白黄链霉菌、娄彻氏链霉菌，再在黄瓜播种后30 d接种南方根结线虫。接种线虫卵悬浮液58 d后，每处理3株植株，3个重复，小心清洗根系，吸干表面水分，用游标卡尺测定茎粗，然后用分析天平测定地上鲜质量、地下鲜质量和全株鲜质量。

1.2.5 放线菌剂对黄瓜根结线虫病和黄瓜生长的综合评价 参考符美英等[18]的方法，计算盆栽幼苗和槽式栽培成株生长指标和病情指标的隶属函数值。综合隶属函数值为所有测定指标的隶属函数值之和，综合隶属函数值越大，表明该放线菌剂对南方根结线虫病的防治能力和对黄瓜的促生能力越强。

生长指标：X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)；

病情指标:X(μ)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中：X为不同放线菌剂预处理某指标的测定值；Xmax为所有处理该指标测定的最大值，Xmin为所有处理该指标测定的最小值。

1.3 数据处理

利用SPSS 22.0软件对试验数据进行单因素方差分析，采用Duncan新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 放线菌剂对黄瓜根结数和根结指数的影响

不同放线菌剂对盆栽苗期及槽式栽培成株期黄瓜根结数和根结指数的影响如表1所示。由表1可知，黄瓜苗期接种南方根结线虫30 d后，与仅接种线虫(Mi)处理相比，预先接种放线菌剂后再接种根结线虫处理Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi黄瓜的根结数显著降低，分别降低了44.56%，39.26%和41.38%，表明3种放线菌剂能显著减少黄瓜幼苗的根结形成；接种娄彻氏链霉菌(D74+Mi)和微白黄链霉菌(T4+Mi)处理的黄瓜幼苗根结指数也显著降低。

表1 放线菌剂对黄瓜根结数和根结指数的影响

由表1还可知，接种南方根结线虫58 d后，与仅接种线虫(Mi)处理相比，预先接种密旋链霉菌、微白黄链霉菌剂后再接种根结线虫处理(Act12+Mi、T4+Mi)显著减少了黄瓜成株期的根结数，分别显著减少23.01%和35.51%，且这2个处理黄瓜的根结指数也显著降低；预先接种娄彻氏链霉菌剂后再接种南方根结线虫处理(D74+Mi)的黄瓜根结指数也显著降低，根结数虽降低但差异不显著；接种微白黄链霉菌剂(T4+Mi)处理黄瓜的根结数和根结指数均最小，表明微白黄链霉菌对黄瓜根结数的形成影响最大。

2.2 放线菌剂对感染根结线虫黄瓜幼苗根系巨细胞的影响

不同放线菌剂对感染根结线虫黄瓜幼苗根系巨细胞的影响结果如图1所示。由图1可知，接种南方根结线虫30 d后，仅接种根结线虫(Mi)处理黄瓜幼苗根系巨细胞中细胞核增多，细胞变大，周围完整的细胞较少，部分形成空洞(图1-A)，巨细胞发育正常；预先接种放线菌剂后再接种根结线虫处理(Act12+Mi、D74+Mi、T4+Mi)黄瓜幼苗根系也均有巨细胞形成(图1-B-D)。与Mi处理相比，预先分别接种娄彻氏链霉菌、微白黄链霉菌剂后再接种根结线虫处理(D74+Mi、T4+Mi)的黄瓜幼苗根系巨细胞发育明显受到阻碍或延缓，巨细胞体积显著减小(图1-C-D)；预先接种密旋链霉菌剂处理(Act12+Mi)的黄瓜幼苗根系巨细胞较其他放线菌剂处理大，但较仅接种线虫处理(Mi)小(图1-B)。表明3种放线菌剂对南方根结线虫巨细胞体积的扩大均有明显的抑制作用，但不同放线菌剂抑制效果不同，其中微白黄链霉菌和娄彻氏链霉菌的抑制效果较为明显。

A.Mi处理；B～D.依次为Act12+Mi、D74+Mi、T4+Mi处理

2.3 放线菌剂对黄瓜生长的影响

2.3.1 苗期盆栽试验 由表2可知，与CK相比，预先接种密旋链霉菌(Act12)、微白黄链霉菌(T4)和娄彻氏链霉菌(D74)处理苗期黄瓜地下鲜质量、全株鲜质量显著增大，接种微白黄链霉菌(T4)和娄彻氏链霉菌(D74)处理黄瓜地上鲜质量也显著增大；预先接种微白黄链霉菌(T4)处理的黄瓜茎粗也显著增大；表明预先接种微白黄链霉菌(T4)和娄彻氏链霉菌(D74)对黄瓜幼苗生长有一定的促进作用，尤其是预先接种微白黄链霉菌(T4)的促生作用更明显。

表2 放线菌剂对盆栽黄瓜幼苗生长的影响

由表2还可以看出，与CK相比，仅接种根结线虫的Mi处理苗期黄瓜茎粗、鲜质量减小，说明根结线虫侵染在一定程度上抑制了黄瓜幼苗的生长。与仅接种线虫的Mi处理相比，Act12+Mi、T4+Mi和D74+Mi处理黄瓜地上鲜质量和全株鲜质量显著增大，说明微白黄链霉菌和娄彻氏链霉菌可有效缓解根结线虫侵染对黄瓜幼苗生长的抑制作用。另外，接种线虫的处理Mi、Act12+Mi、T4+Mi和D74+Mi的全株鲜质量比相应的不接种处理CK、Act12、T4、D74分别下降了22.45%，12.17%，1.32%和10.29%。其中，与仅接种微白黄链霉菌的处理(T4)相比，T4+Mi处理使黄瓜全株鲜质量下降最少。因此预先接种微白黄链霉菌对根结线虫侵染抑制幼苗生长的缓解作用最大。

放线菌剂对黄瓜幼苗根系生长的影响如图2所示。由图2可知，与CK处理相比，接种不同放线菌剂对黄瓜根系的促生效果不同，预先接种微白黄链霉菌(T4)和娄彻氏链霉菌(D74)对黄瓜幼苗根系的生长有显著促进作用，处理后须根明显增多，根系生长旺盛。仅接种线虫处理(Mi)的黄瓜根系有明显根结形成，而预先接种不同放线菌剂再接种线虫处理(Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi)根系的根结数明显减少，其中预先接种微白黄链霉菌(T4)和娄彻氏链霉菌(D74)根系的侧根明显发达，根毛多，根系生长旺盛，说明微白黄链霉菌(T4)和娄彻氏链霉菌(D74)的促根作用更明显。

A.CK；B-H.依次为Act12、T4、D74、Mi、Act12+Mi、T4+Mi、D74+Mi处理

2.3.2 温室槽式栽培成株试验 温室槽式基质栽培的各处理黄瓜成株期生长指标测定结果如表3所示。由表3可知，与仅接种线虫处理(Mi)相比，接种微白黄链霉菌剂后再接种线虫处理(T4+Mi)成株期黄瓜植株地上鲜质量、地下鲜质量和全株鲜质量均显著升高，Act12+Mi和D74+Mi处理黄瓜植株地下鲜质量也显著增大。表明在线虫侵染条件下，预先接种微白黄链霉菌对黄瓜成株生长也具有明显的促进作用。

表3 放线菌剂对温室槽式栽培黄瓜生长的影响

综上可知，无论在黄瓜幼苗期还是成株期，甚至在线虫侵染条件下，预先接种微白黄链霉菌剂均对黄瓜生长具有较好的促生作用。

2.4 放线菌剂对黄瓜根结线虫病的防治效果和黄瓜促生作用的综合评价

由表4可以看出，综合幼苗期和成株期不同处理黄瓜根结线虫病病情指标和生长指标，T4+Mi处理的综合隶属函数值最大，分别为5.13和6.00，表明微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)对黄瓜南方根结线虫病的缓解能力最强；其次是D74+Mi处理，其综合隶属函数值分别为4.71和2.69，表明娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei)对黄瓜南方根结线虫病的缓解能力次之；Act12+Mi的综合隶属函数值最小，表明密旋链霉菌(Streptomycespactum)对黄瓜南方根结线虫病的缓解能力最弱。

表4 放线菌剂对黄瓜根结线虫病的防治效果和黄瓜促生作用的综合评价

3 讨 论

根结线虫的化学防治主要是化学杀线剂的使用，分为熏蒸法和非熏蒸法。常用的熏蒸杀线剂有溴甲烷、氯化苦、二氯丙烯、威百亩、棉隆、敌线酯等，非熏蒸杀线剂有阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、噻唑磷、灭线磷、涕灭威和克百威等，这些化学杀线剂毒性强、安全性差、对环境有破坏作用[20-21]。随着农业可持续发展观念的不断深入，生物控制线虫的方法越来越受重视[3,22-23]，用真菌、细菌、放线菌、捕食性线虫等制成生防制剂代替化学农药防治根结线虫病害[24]。本研究中，与Mi处理相比，预先接种密旋链霉菌(Act12)、微白黄链霉菌(T4)、娄彻氏链霉菌(D74)后再接种根结线虫，其根结数分别降低了44.56%，39.26%和41.38%，其根结指数也明显降低。本研究所采用的3种放线菌剂均筛选自土壤，是一种环境友好型微生物菌剂，对设施蔬菜产业的可持续性发展奠定了良好的基础。

根结线虫侵染蔬菜植株的根部，破坏了植株的根系组织，改变土壤pH和微生物群落[3]。线虫侵染初期，植株叶片净光合速率下降，根系侵染点呼吸作用增强，生物膜透性增加，内源激素代谢失调，氮磷钾在根部积累，可溶性蛋白、还原糖等生物大分子含量提高[25]。放线菌作为一类控制植物病原传播的重要微生物资源，对病原生物有很高的拮抗作用和寄生性，其作为根结线虫的生防菌株具有巨大的潜能[26]。一直以来，对于控制植物寄生线虫的研究主要集中在真菌方面，对放线菌的研究多在其代谢产生的活性物质方面，用放线菌来防治植物寄生线虫的研究相对较少。本研究系统比较了接种密旋链霉菌(Act12)、微白黄链霉菌(T4)、娄彻氏链霉菌(D74)对黄瓜根结线虫病的缓解作用，结果发现不同放线菌剂对根结线虫的抑制作用不同，都表现出根结数减少，根结指数变小的表型，其中预先接种微白黄链霉菌(T4)对黄瓜根结线虫病害的缓解作用最为显著。

放线菌菌丝生长过程中产生的次级代谢产物具有杀灭其他微生物、促进作物生长发育、改善土壤生态环境、提高作物品质和产量以及对环境无污染等优点。链霉菌不仅可促进蔬菜作物根结线虫病病株生长，降低发病率；其对根系生长的强烈刺激作用将促进根系吸收土壤中的养分和水分，是作物生长量增加的基础[10,15-16]。本研究结果发现，不同放线菌剂对黄瓜生长的促进作用有差别，预先接种微白黄链霉菌(T4)和娄彻氏链霉菌(D74)的黄瓜幼苗生物量高于未接种链霉菌处理，且成株期地上生物量明显高于未接种链霉菌处理，而预先接种密旋链霉菌(Act12)的效果相对较差，综合评价结果表明，预先接种微白黄链霉菌(T4)对黄瓜促生、缓解根结线虫病效果最为显著，娄彻氏链霉菌(D74)次之。

4 结 论

与仅接种根结线虫处理(Mi)相比，预先接种密旋链霉菌、微白黄链霉菌和娄彻氏链霉菌后再接种根结线虫，黄瓜根系的根结数和根结指数显著降低，根内巨细胞发育受阻或延缓，巨细胞体积显著减小，地下和全株鲜质量显著增加。综合评价结果表明，预先接种微白黄链霉菌对南方根结线虫病的缓解能力和对黄瓜的促生能力最强，娄彻氏链霉菌次之。