龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫体内抗衰老作用研究

安苗青，徐雅囡，卓倩婷，谢斯威，陈宏著，杜冰，黎攀

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642；2.华南农业大学数学与信息学院，广东广州 510642）

衰老是一种自然的、普遍的、不可逆转的自发性生理过程，同时伴有器官退行性障碍[1-2]，主要由环境因素和遗传共同介导。现代医学研究表明，随着年龄的增长，机体代谢速度缓慢，体内会产生过量的活性氧自由基（ROS）。当ROS水平超出正常水平时会导致机体应激损伤，破坏免疫系统，最终导致寿命缩短[3-4]。ROS也是导致高血压、心血管疾病和阿尔兹海默症的重要原因[5]。临床上为延长寿命通常使用人工合成的抗氧化剂来增强抗氧化酶的活性以清除体内自由基，但这些抗氧化剂长期服用会对人体产生危害。因此，开发具有抗衰老作用的天然活性药物具有重要的意义。

中医学认为，肾精不足、气血亏虚是导致衰老的主要病因[6]。龟鹿二仙胶为延缓衰老的效验方，最早见于明代王三才的《医便》，其方剂组成为鹿角10斤、龟板5斤、人参15两、枸杞子30两，四药合用，多用于虚损精极、遗泄、瘦削少气及目视不明等症[7]。既往学者们对龟鹿二仙胶抗衰老作用进行了大量的药理学实验。王树鹏等[8]观察龟鹿二仙胶颗粒对自然衰老小鼠学习记忆能力的影响，连续给药3个月后，发现小鼠错误反应期延长，逃避反应期显著缩短且错误反应次数减少。WANG等[9]研究结果表明，龟鹿二仙胶通过降低p16INK4a、p53和p21Cip1/Waf1蛋白的表达，可缓解化疗药物诱导造血干细胞的衰老。梁征洋等[10]将龟鹿二仙胶作用于D-半乳糖致衰老小鼠，发现药物组中丙二醛（MDA）含量较模型组下降、超氧化物歧化酶（SOD）活性显著较模型组升高。以上研究均表明龟鹿二仙胶具有抗氧化的功效，但其在抗衰老方面的研究甚少且具体作用机制尚不清楚。

秀丽隐杆线虫作为一种新型抗衰老评价模型，具有易于饲养、结构简单、生命周期短、与人类基因保守性较高的特点，是国际上公认的抗氧化和延缓衰老研究的优势模型[11-12]，广泛应用于先天免疫、氧化胁迫效应和环境暴露与损伤等的机制研究中[13]。因此，本研究以秀丽隐杆线虫为研究对象，通过对线虫寿命、行动力、产卵量、脂褐质水平、氧化应激及抗氧化酶活性等相关指标进行分析，进一步探讨龟鹿二仙胶的抗衰老机制，为扩大其在市场上的广泛应用提供研究基础，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 动物与细菌N2野生型秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，the Bristol strain N2）购于美国Caenorhabditis elegansGenetics Center；大肠埃希氏菌OP50（E.coliOP50），由华南农业大学食品学院曹康课题组赠送。

1.2 药物、试剂与仪器鹿角、龟板、枸杞子、肉桂、西洋参，购自亳州中药材市场，由华南农业大学食品学院肖南实验员鉴定。虾青素标品，索莱宝生物试剂有限公司生产，批号：SA8730。胡桃醌、琼脂、胰蛋白胨、链霉素硫酸盐、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸缓冲溶液、2’，7’-二乙酸二氯荧光素（2’，7’-dichlorofluorescin diacetate，H2DCF-DA），购自广州齐湘生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等检测试剂盒，购自南京城建生物工程研究所。FA2204万分之一天平（上海舍岩仪器有限公司）；SN-HWS 250B恒温生化培养箱[甘易仪器设备（上海）有限公司]；LD-SY96S多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；MF53-N荧光显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）；LC-LX-HR185C冷冻离心机（日本久保田公司）。

1.3 药物及制备龟鹿二仙胶的制备：利用超声波将400~600份鹿角和200~300份龟甲清洗干净，鹿角完全浸泡20~40 d，经过3次熬煮后进行酶解，然后在酶解液中加入10~20份肉桂、40~50份西洋参和80~100份枸杞子恒温熬煮1~6 h，最后浓缩罐装。

2 实验方法

2.1 分组实验分5组：空白组（不处理）、龟鹿二仙胶低剂量组（0.5 mg/mL）、龟鹿二仙胶中剂量组（2.5 mg/mL）、龟鹿二仙胶高剂量组（5 mg/mL）、阳性对照组（虾青素0.64μmol/mL）。

2.2 线虫的培养及传代用涂有大肠杆菌OP50的标准培养基，在20℃培养箱中恒温培养线虫。成年的秀丽隐杆线虫分为雌雄同体和雄性两种性别，传代时挑取处于产卵期的单个雌雄同体的线虫于新的涂有E.coliOP50的NGM培养基，20℃恒温培养。

2.3 线虫同期化培养为保证实验过程中所有线虫处于同一生长时期，要将其进行同期化处理。本实验采用高氯酸钠漂白法进行同期化培养：由于年轻成虫体内有较多虫卵，故采用1 mL M9缓冲溶液将年轻成虫冲洗至无菌EP管中，加入1 mL裂解液裂解线虫，震荡3.5 min，在低速离心机上以3 000 r/min（离心半径5 cm）离心1 min，除去上清液。再用M9冲洗2~3次，离心弃上清后用移液枪吸取EP管底部线虫滴于NGM无菌区，约48 h后虫卵基本发育成L4期幼虫，完成同期化操作。

2.4 线虫寿命的测定挑取同期化的L4期幼虫到新的各组培养板上（每组4个平板，每个平板20条）继续培养。从转移时刻开始计算存活时间，到生殖后期（通常为第4天）每2 d就将线虫转移到新的各组培养板上以保证药物浓度。隔天探视线虫，记录死亡线虫数，记录线虫生存、死亡及剔除实验的条数，直至所有组线虫全部死亡[14]，实验结束。实验重复3次。计算线虫平均寿命和最高寿命，其平均寿命为线虫全部死亡时间的平均值，最高寿命为线虫最后存活数量的10%时的平均寿命[15]。

线虫死亡的评判标准：无移动或吞咽动作，轻触后仍无反应。剔除标准：①逃离至培养皿壁或盖上而干死；②虫卵在体内孵化成袋样虫；③钻入琼脂中。剔除意外死亡、逃逸和袋样虫。

2.5 线虫运动能力的测定与寿命试验同时进行，线虫的运动能力测定参考YANG等[16]的研究方法。用铂丝轻触线虫身体，30 s内若线虫表现出连续协调的正弦运动，则记为快速运动；反之则记为缓慢运动。记录标准：①线虫自发运动，不需要触碰刺激，记为“A”；②线虫必须受到触碰刺激才运动，记为“B”；③线虫受到触碰刺激后只摆头或尾，记为“C”。

2.6 线虫产卵量的测定将线虫同期化培养后，每组挑取10条处于L4期的线虫到各组培养基中，每份线虫培养基上放置1条线虫。每隔24 h将线虫转移至新的平板中，转移4~5次后，线虫基本不再产卵。然后将所有平板继续放在培养箱中继续培养，待子代线虫孵化长大后，在其进入产卵之前（20℃孵育24 h）对平板上的线虫进行计数，即可得到每个线虫的产卵量。

2.7 吞咽频率的测定挑取同期化的L4期幼虫到新的各组培养板上（每组4个平板，每个平板20条）继续干预5 d后，每组随机挑取10~15条线虫，测定其在1 min内吞咽的次数。测定方法：在显微镜下用铂丝轻轻触碰线虫身体观测其咽部肌肉1 min内抽动的次数。独立重复进行3次。

2.8 线虫应激寿命实验

2.8.1 线虫热应激寿命 挑取同期化的L4期幼虫到新的各组培养板上（每组4个平板，每个平板20条）继续干预5 d，再转移到37℃环境中继续培养，每小时在倒置荧光显微镜下计算线虫的生存和死亡个数，并绘制生存曲线，直至所有线虫全部死亡。实验重复3次。

2.8.2 线虫紫外应激寿命 挑取同期化的L4期幼虫到新的各组培养板上（每组4个平板，每个平板20条）继续干预5 d，转移到紫外照射环境中培养12 h后，在倒置显微镜下跟踪计算线虫的生存和死亡个数，绘制生长曲线，直至所有组线虫死亡。实验重复3次。

2.8.3 线虫胡桃醌氧化应激寿命 挑取同期化的L4期幼虫到新的各组培养板上（每组4个平板，每个平板20条）继续干预5 d，然后转移至含有240μmol/L胡桃醌（先乙醇溶解，再加入培养基）的培养基，每组50条。每天记录线虫的生存及死亡个数，并绘制生存曲线，直至所有线虫死亡。实验重复3次。

2.9 线虫体内ROS及脂褐质水平测定ROS水平测定：挑取同期化的L4期幼虫到新的各组培养板上（每组4个平板，每个平板20条）继续干预5 d后，用M9缓冲溶液冲洗培养基3次，转移到离心管中离心取上清液。吸取50μL上清液和50μL H2DCF-DA避光混匀后，在激发波长485 nm、发射波长530 nm的荧光显微镜下每10 min进行1次荧光强度测定。连续测定2 h，并以上清液蛋白质浓度进行相对荧光强度标准化。

脂褐质水平测定：选取同期化的L4期幼虫到新的各组培养板上（每组4个平板，每个平板20条）继续干预7 d，用1%叠氮化钠溶液将其麻醉，随即转移到2%琼脂糖凝胶垫片上，然后通过荧光显微镜（激发波长365 nm、发射波长420 nm），单色数码相机以及Image Pro Plus software获取荧光图像。

2.10 体内抗氧化酶活性测定同期化后的线虫生长到L4期后，将各组线虫转移到NGM培养基上，分别以不同浓度的样品干预5 d，用M9缓冲溶液冲洗培养皿并收集各板上的成虫。冷冻研磨后离心，弃上清液，最终制成5%的线虫匀浆，参照相关试剂盒进行SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的测定，并以上清液蛋白质浓度进行标准化。

2.11 统计方法实验均重复进行3次。实验结果均用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析并用最小显著性差异法进行多重比较，显著水平设置为P＜0.01或P＜0.001。另外，使用GraphPad（Windows 5.00版）软件进行log-rank检验分析生存曲线显著性。

3 结果与分析

3.1 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫寿命的影响本研究以虾青素为阳性对照。有研究表明，虾青素可有效清除自由基，抑制体内过氧化反应，能够延缓线虫寿命[17-18]。本研究结果如图1、表1所示，与空白组相比，不同浓度的龟鹿二仙胶均提高了秀丽隐杆线虫的平均健康寿命。空白组线虫平均寿命为（14.88±1.58）d，阳性对照组线虫的平均寿命为（27.73±5.01）d，而龟鹿二仙胶低剂量组线虫的平均寿命和最长寿命分别延长至（18.93±4.20）d和（28.07±5.82）d，其效果与虾青素阳性对照组相当，且与空白组相比形成显著性差异（P＜0.01），表明龟鹿二仙胶能够有效地延长线虫的健康寿命。

表1 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫平均寿命和最长寿命的影响Table 1 Effects of Guilu Erxian Jiao on average and maximum life span of Caenorhabditis elegans（±s）

表1 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫平均寿命和最长寿命的影响Table 1 Effects of Guilu Erxian Jiao on average and maximum life span of Caenorhabditis elegans（±s）

①P＜0.01，与空白组比较

组别空白组龟鹿二仙胶低剂量组龟鹿二仙胶中剂量组龟鹿二仙胶高剂量组阳性对照组中位生存时间/d 15.00±2.83 18.67±4.50①17.00±2.94 17.67±3.30①18.33±3.86平均寿命/d 14.88±1.58 18.93±4.20①17.17±3.41①16.84±3.18①18.22±3.28最长寿命/d 23.67±2.70 28.07±5.82①25.80±5.16 25.53±4.36 27.73±5.01

图1 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫寿命的影响Figure 1 Effects of Guilu Erxian Jiao on life span of Caenorhabditis elegans

3.2 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫行动能力的影响线虫运动能力与线虫寿命有直接关系，能够有效地评价机体的衰老速度[19]。本研究观察龟鹿二仙胶对线虫第4、8、12、16天运动能力的影响，结果如图2所示：当线虫处于生命早期阶段（第4天），空白组、龟鹿二仙胶各剂量组和阳性对照组均有90%左右的线虫保持在A状态；第8天，空白组、龟鹿二仙胶各剂量组和阳性对照组线虫运动能力与第4天相比，A状态的线虫显著减少，此时线虫大部分处于B状态；在线虫中晚期阶段（第12天），除阳性对照组有6%线虫处于A状态，龟鹿二仙胶低、中、高剂量组中分别有80%、90%和83%的线虫保持在运动B状态，与空白组相比分别提高了31%、48%和36%。可见龟鹿二仙胶可以显著提高线虫的运动能力，且浓度在2.5 mg/mL时其效果最好，进一步说明龟鹿二仙胶不仅可以延长线虫寿命还可以提高线虫行动力。

图2 不同浓度龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫运动能力的影响Figure 2 Effects of different concentrations of Guilu Erxian Jiao on the motility of Caenorhabditis elegans

3.3 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫产卵量的影响线虫通常在L4期的前4 d具有很高的繁殖能力。本研究结果如图3-A所示，随着线虫的衰老，产卵量逐渐降低。龟鹿二仙胶组第2、3天线虫产卵量高于空白组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。如图3-B结果显示，龟鹿二仙胶样品组总产卵量与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。可见龟鹿二仙胶干预对线虫的生殖能力没有影响，表明龟鹿二仙胶延长秀丽隐杆线虫寿命并没有打破“能量守恒学说”，故其可能不是通过“饮食限制”来延长线虫寿命的[20]。

图3 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫产卵量的影响Figure 3 Effects of Guilu Erxian Jiao on oviposition quantity of Caenorhabditis elegans

3.4 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫吞咽频率的影响结果如图4所示，与空白组比较，龟鹿二仙胶低剂量组线虫的吞咽运动频率升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），中剂量组和高剂量组线虫的吞咽运动频率显著升高（P＜0.001），表明龟鹿二仙胶加快了线虫的摄食能力，具有一定的抗衰老能力。

图4 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫吞咽频率的影响Figure 4 The effect of Guilu Erxian Jiao on swallowing frequency of Caenorhabditis elegans

3.5 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫应激能力的影响如图5-A所示：与空白组相比较，经龟鹿二仙胶干预后，线虫在37℃热应激压力下的存活率曲线明显向右移动；此外，与空白组比较，龟鹿二仙胶低剂量组的存活率提高了13%，中剂量组和高剂量组的存活率分别提高了19%和21%。结果表明，龟鹿二仙胶能明显增强线虫热抵抗力，并以剂量依赖的方式延长线虫寿命。

继而检测线虫抗紫外胁迫能力，结果如图5-B所示，在紫外照射环境下，龟鹿二仙胶各剂量组线虫存活时间较空白组延长，其中，高剂量组（5 mg/mL）线虫存活时间可达到216 h，较空白组寿命延长了73%。

研究[21]表明，胡桃醌能够使处于其中的线虫在短时间内产生大量的氧自由基，引起氧化应激，导致线虫体内急性氧化损伤。本研究结果如图5-C所示，经龟鹿二仙胶样品干预后的线虫存活率曲线明显向右移动，低、中、高剂量组存活率较空白组分别提高了36%、44%和56%。

图5 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫应激能力的影响Figure 5 The effect of Guilu Erxian Jiao on the stress ability of Caenorhabditis elegans

以上结果表明，龟鹿二仙胶在热应激、紫外应激、胡桃醌应激等压力环境下均可以延长线虫寿命，这与根皮素和益智仁对线虫应激能力的影响结果相一致[22-23]。具体结果见表2。

表2 不同条件对各组秀丽隐杆线虫应激能力的影响Table 2 Effects of different conditions on stress ability in each group of Caenorhabditis elegans

3.6 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫脂褐质及ROS水平的影响如图6-A、图6-B所示，龟鹿二仙胶低、中、高剂量组L4期线虫体内脂褐质水平较空白组显著降低（均P＜0.001），且呈剂量依赖性，其中，高剂量组（5 mg/mL）脂褐质水平较空白组降低了65.78%。结果表明龟鹿二仙胶具有较好地降低线虫体内脂褐质含量的能力。线虫体内ROS随着时间的延长而增多。第5天，各组线虫体内ROS水平如图6-C所示，龟鹿二仙胶低、中、高剂量组的ROS水平较空白组显著降低（均P＜0.001），表明龟鹿二仙胶可以有效降低线虫体内ROS水平，进而降低体内脂褐质的堆积。

图6 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫脂褐质及ROS水平的影响Figure 6 Effects of Guilu Erxian Jiao on lipofuscin leveland ROS levelof Caenorhabditis elegans

3.7 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫体内氧化应激指标的影响结果如图7所示，与空白组比较，龟鹿二仙胶低、中、高剂量组和阳性对照组线虫体内抗氧化应激指标SOD、CAT和GSH-Px酶活性均显著升高，其中，高剂量组差异有统计学意义（P＜0.001）。龟鹿二仙胶低、中、高剂量组和阳性对照组线虫体内氧化产物MDA含量显著降低，较空白组分别降低了15.24%、24.69%和30.24%。结果表明龟鹿二仙胶能够有效地提高秀丽隐杆线虫体内抗氧化能力，减轻氧化损伤，延长线虫寿命，当浓度为5 mg/mL时，效果更明显。

图7 龟鹿二仙胶对秀丽隐杆线虫体内氧化应激指标的影响Figure 7 Effects of Guilu Erxian Jiao on oxidative stress indexes of Caenorhabditis elegans in vivo

4 讨论

中医学对衰老的研究历史悠久，中医认为衰老的主要病机为阴阳失调、脏腑衰虚、精气衰竭，常用健脾补气、养阴补阳、补肾填精的中草药进行调理[24]。龟鹿二仙胶具有滋阴补阳、健肾补脾、延缓衰老的功效[7]，但其作用机制尚不明确。本研究采用秀丽隐杆线虫衰老模型，首次研究龟鹿二仙胶在延长寿命的同时对线虫基础生理指标的影响。

自由基是衰老过程中最重要的因素之一，高温会导致机体内部代谢紊乱、酶失活以及氧气传输受阻，使机体内产生大量的活性氧，引起氧化应激[20，25]。经过紫外线长时间照射，机体内自由基平衡会被打破，甚至引起蛋白质变性和DNA损伤，最终加速衰老[26]。也有研究表明，胡桃醌在线虫体内发生氧化还原反应时会诱导细胞产生氧化应激反应，短时间内产生大量的自由基，从而引起急性氧化损伤[27]。ROS的过量堆积不仅会导致脂质过氧化，产生大量的MDA，还会破坏蛋白质，引起氧化应激，因此通过抑制ROS的积累可以延缓衰老[28]。另外，机体也会分泌CAT、SOD和GSH-Px等酶类物质抑制体内ROS的积累，因此，提高线虫体内抗氧化酶活性是至关重要的。提示延缓线虫衰老的作用机制与抗氧化作用、清除或抑制自由基、增强抗衰老活性和调控衰老相关基因等[29]有关。

本实验结果显示，龟鹿二仙胶能够延长健康和应激条件下线虫的寿命，提高其运动能力和吞咽频率以及体内SOD、CAT和GSH-Px酶的活性，同时降低线虫体内ROS、脂褐质的积累以及MDA含量，故龟鹿二仙胶可能是通过降低体内ROS含量、提高机体抗氧化酶活性来降低体内氧自由基蓄积，减缓细胞氧化损伤，进而起到延长寿命的作用。