4 种药剂对浙江景宁云锦杜鹃叶斑病菌的室内毒力测定*

刘浩凯 刘卫荣 张 辉 李 桥 仇辉康 陈春林 陈玲芳

（1.景宁县畲族自治县自然资源和规划局，浙江 景宁 323500；2.景宁畲族自治县生态林业发展中心，浙江 景宁 323500）

云锦杜鹃(Rhododendron fortunei)为杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃属(Rhododendron)常绿杜鹃亚属常绿灌木或小乔木，高3～12 m，主要分布在我国广东、广西、福建、浙江等省，生长于海拔600～2 000 m 的山脊阳处或林下,有较高的观赏价值和医用价值[1]。云锦杜鹃生长以景宁县上山头和大仰湖湿地自然保护区居多，呈自然生长状态。

目前关于云锦杜鹃的研究[2]主要集中在群落学[3]、光合生理生化[4]、次级代谢产物[5]等,其中，对杜鹃病害研究多以叶部病害为主，主要有叶斑病(Cercospora rhododendri)、煤污病(Capnodium sp)、灰霉病(Sclerotinia fuckeliana)等[6-10]。2017 年，景宁县上山头天然杜鹃林中的云锦杜鹃发生较为严重的叶斑病，进行分离得到引起该病害的致病菌为芦笋拟茎点霉(Phomopsis asparagi)[11]，该病原菌主要侵染云锦杜鹃的叶片。发病初期，出现褐色小斑点，随后发展成为黑褐色的圆形或不规则病斑，在后期时，病斑周围甚至出现黄色晕圈，其叶斑病症状与以往报道[6-8]有所不同，本研究为芦笋拟茎点霉在浙江省内引起云锦杜鹃叶斑病的首次报道。本文采用菌丝生长速率法[12]，选择4 种常用的杀菌剂多菌灵、甲基硫菌灵、百菌清和代森锰锌，对芦笋拟茎点霉进行毒力测定[13,14]，以达到筛选高效杀菌剂的目的，旨在为今后科学防治云锦杜鹃叶斑病提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株及培养基

供试菌株芦笋拟茎点霉保存于山西农业大学生命科学学院-80 ℃超低温冰箱。将供试菌株转移至PDA 培养基中，25 ℃，光照培养7 天后备用。供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA 培养基）。

1.1.2 供试药剂

试验所选用的4 种供试药剂为农业生产上常用的用于预防治疗叶斑病的杀菌剂，分别为50%多菌灵、80%甲基硫菌灵、75%百菌清、80%代森锰锌。

1.2 试验方法

1.2.1 母液制备及试验浓度确定

取4 种药品溶解在无菌水中，配置成浓度为5×103mg/L 的母液，4 ℃下保存备用。将4 种药剂加在50 mL 的PDA 中，使其浓度为5 μg/mL[15]，混和均匀，制成含药剂的平板，未加入药剂的培养基为空白对照。将待测菌株接种在PDA 平板上，从第3 天开始计算其菌落直径的大小，然后每隔1 天进行相同的测量（两轴之间呈90°测量，2 次数据取平均值），测量到第7 天的数据时结束，试验重复3 次。计算病原菌在不同浓度药剂作用下的抑菌率[16]，根据其抑菌率调整各药剂终浓度（表2）。

表2 4 种药剂的浓度梯度

1.2.2 不同杀菌剂对病原菌的毒力测定

将4 种药剂按照表1 的浓度加入PDA 培养基中，制备成不同浓度梯度的含药培养基。随后对病原菌进行抑菌率分析，方法同1.2.1。根据浓度对数(X)和抑制菌落生长百分率的机率值(Y)，计算回归方程Y＝AX＋B，回归方程表示4 种不同杀菌剂对这种病原菌毒力，最后得到各自的相关系数和半数致死量，求出EC50和R2。

表1 供试药剂厂家及浓度

1.3 数据处理

对所测得的数据用EXCEL 和SPSS17.0 进行整理并加以Duncan 分析。

2 结果与分析

2.1 4 种药剂对病原菌的抑制效果

由图1 可知，4 种药剂对病原菌生长均表现有一定的抑制作用，且随着药剂浓度的增加，抑菌效果逐渐明显。当百菌清和代森锰锌的浓度为50μg/mL时，抑菌率仅为63.21%和61.15%（图2、图3），抑菌效果差异不显著；当药剂浓度为25、12.5、6.25 μg/mL时，百菌清的抑菌效果明显好于代森锰锌，百菌清的抑菌率虽有变化，但没有代森锰锌明显。而对于多菌灵，当浓度为2.5 μg/mL 时，抑菌率为95.01%（图4），并且随着药剂浓度的降低，都保持着较高的抑菌效果；甲基硫菌灵的抑菌效果略低于多菌灵，在浓度为12.5μg/mL 时，抑菌率为87.59%（图5）。

图1 4 种杀菌剂的抑菌率及相对生长速率测定

图2 百菌清不同浓度对病原菌抑菌效果

图3 代森锰锌不同浓度对病原菌抑菌效果

图4 多菌灵不同浓度对病原菌抑菌效果

图5 甲基硫菌灵不同浓度对病原菌抑菌效果

2.2 毒力回归方程分析

根据药剂浓度，利用药剂的浓度对数值x 与药剂抑菌率几率值y 的直线相关关系，计算出药剂的毒力回归方程，求出相关系数以及EC50。由表3 可知：这4 种药剂对芦笋拟茎点霉的抑制效果均较好，EC50值差值较大。其中50%多菌灵抑制能力最强，EC50为0.97 mg/L；80%甲基硫菌灵和75%的百菌清次之，EC50分别为2.16 mg/L 和9.16 mg/L；80%代森锰锌的EC50最大，为32.79 mg/L，抑菌效果最差。4 种杀菌剂的抑菌效果排序从高到低分别为：50%多菌灵＞80%甲基硫菌灵＞75%百菌清＞80%代森锰锌。

表3 供试药剂对病原菌毒力测定

3 讨论

拟茎点霉是一种植物病原真菌，分布广泛，可在油棕[16]、葡萄[17]、广东凤梨[18]等植物上发病。由芦笋拟茎点霉引起的叶斑病是出现在云锦杜鹃的病害之一，严重影响其观赏价值。

3.1 试验结果表明，4 种药剂对芦笋拟茎点霉均有抑制作用，毒力作用从高到底为50%多菌灵＞80%甲基硫菌灵＞75%百菌清＞80%代森锰锌。已有研究证实，多菌灵和百菌清对芦笋茎枯病有较好的防治效果，虽本文所分离出的病原菌与芦笋茎枯病的病原菌相同，但同样是多菌灵，0.12μg/mL 的浓度下，抑菌率能达到95.12%，而本试验当浓度为2.5μg/mL 时，抑菌率为95.01%，这可能是由于寄主不同，而导致引起不同的防治效果。

3.2 1980 年以来，苯并咪唑类杀菌剂得到广泛的使用，在农业上可防治多种真菌病害，效果非常显著[21]。分析其作用机理发现，多菌灵与敏感生物的微管蛋白有高度的亲和力，它束缚微管蛋白亚基，使其不能正常组装在有丝分裂过程中起重要作用的纺锤丝。另外，还可影响微管蛋白在保持细胞形态结构和细胞内细胞器的运动。甲基硫菌灵同样属于苯并咪唑类,是一种内吸性杀菌剂。因此对于该病害的防治可以采用2 种药剂混合使用，达到延缓病菌生长及抗性的产生，达到较好的防治效果。

3.3 虽然较高浓度的杀菌剂使用——特别是苯并咪唑类，可以达到延缓真菌生长速率，但是长时间容易在病原菌群体中产生抗性菌株，这导致高剂量的同种药剂，或者同类型药剂容易丧失防治效果。因此，在针对苯并咪唑类的药剂使用时，一定要充分考虑药剂的合理利用，尽可能降低一种或一类杀菌剂的单独使用，多结合其他药剂混合使用，缓解病菌选择性压力。