“冰垫”在术中快速冰冻切片中的应用价值

张盛

(湖北省肿瘤医院病理科，武汉 430079)

病理术中快速冰冻诊断可以确定术中切除标本的良恶性、判断肿瘤的转移情况、确定手术切缘或邻近组织器官是否有肿瘤浸润或残留等，可以帮助临床医生在手术过程中尽快决定下一步手术方案，目前已成为病理科的一项重要工作。高质量且快速的术中快速冰冻诊断能缩短患者术中麻醉时间和临床医生的等待时间。优化冰冻切片流程，提高冰冻切片质量，可大大减少漏诊和误诊。众所周知，冰晶形成是影响冰冻切片质量的重要因素之一。对于组织样本周围的水溶液，可在冷冻前，采用滤纸吸干的方法。而对于细胞内的水分需要在冰冻切片的制片过程中，尽量加快组织冷冻速度，从而使冰晶对组织的影响程度降到最低[1,2]。为加快组织冷冻速度，传统方法是将组织放置于提前预冷的样品托，加入包埋剂后冷冻，但存在切片时组织剥离的风险。本文通过预先在组织样品托上加入少量包埋剂，制作出一层厚约 0.1 cm的“冰垫”，后将术中新鲜组织标本放置于带有“冰垫”的样品托上，包埋冷冻后切片。该方法既可大大缩短冰冻制片时间，又明显改善冰冻切片中的出现的冰晶现象，提高冰冻切片的质量，现介绍如下。

材料与方法

1 材料

选取湖北省肿瘤医院病理科术中快速室2021年4—5月份术中送检新鲜标本（包括甲状腺、乳腺和肺各20例）。

2 主要设备与试剂

设备：冰冻切片机（NX70，Thermo），组织染色机（HRS-18C，汉谷医疗）；试剂：普通液体合成胶水（宜兴市申达文具有限公司），乙醇-甲醛-乙酸（AFA）固定液，无水乙醇、二甲苯（国药试剂），1%盐酸酒精分化液，饱和碳酸锂返蓝液，苏木素、伊红（贝索生物）等， BRAF V600E、HER-2和Ki-67一抗均购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。

3 方法

首先，制作带有“冰垫”的样本托：在组织样本托头上加入约 1～2 mL的胶水，置于冰冻切片机内，5 s后轻轻放置冰锤于胶水上，待胶水凝固后挪走冰锤，便制成带有“冰垫”的托头，放置于冰冻切片机的箱体内备用。接着，将术中送检新鲜手术标本随机分为 2组，分别采用无“冰垫”法和有“冰垫”法两种不方法冷冻包埋。无“冰垫”法：将组织放置于样本托上，加适量胶水包埋后放入冰冻切片机速冻台上进行速冻；有“冰垫”法：从冰冻切片机中取出预先制备好的带“冰垫”托头，将组织放置“冰垫”上，加适量的胶水后放入冰冻切片机速冻台上进行速冻。最后，两组组织样本均按照常规进行切片、固定、HE染色、封片和镜检。

4 对比指标

切片时间：两组均从组织放置冰冻切片机的速冻台上开始计时，待切片HE染色封片完成后计时结束。

切片质量：由病理技师对60例冰冻切片的染色结果进行盲法评片。本实验主要观察切片有无裂隙、胞内外冰晶形成情况以及组织结构清晰度3项重要指标。具体评分标准如下：①若整张切片几乎无裂隙、无冰晶形成、组织结构清晰，则各项均得10分；②若切片中见少量裂隙、少量冰晶形成，组织结构尚清晰且不影响观察判断，则各项得分减1～2 分；③若切片中见较多裂隙、大量冰晶形成，组织结构不清晰并且一定程度上影响观察，则各项得分减 3～6 分；④若切片中见大量裂隙、大量冰晶形成，组织结构模糊不清并且严重影响诊断，则各项得分减 7～10 分。最终取两位技术人员评分的平均值作为每张切片的最终得分。3项指标中每一项指标的得分都大于7.5分为切片质量佳，其余情况为切片质量不佳。3项指标均大于或等于9分为优，均大于或等于8分为良，均小于6分为不合格，其余为基本合格。

免疫组织化学染色：同一新鲜组织标本对剖后分别采用有“冰垫”和无“冰垫”法进行冰冻切片后，均按照相同程序及时固定、常规脱水包埋、切片后进行免疫组织化学染色。具体步骤如下：组织切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精水化后，修复液中100 ℃煮沸2 min，自然冷却至室温。内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min后滴加即用型一抗，室温下孵育60 min。PBS冲洗后滴加酶标二抗，室温孵育15 min。PBS洗涤后滴加显色液（DAB），显色3～10 min，显微镜下观察掌握染色时间，阳性染色为棕黄/褐色。苏木素复染15～30 s，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。

5 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用均值±标准差表示，采用配对样本非参数检验比较两组切片时间和切片质量间有无差异。计数资料则采用卡方分析比较两组切片优良率间有无差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1 有“冰垫”法冰冻切片时间较短

无“冰垫”组的切片时间为410.17±18.55 s，而有“冰垫”组的切片时间为328.57±13.34 s。与无“冰垫”组相比，有“冰垫”组的切片时间大大缩短（表1）。

表1 两种冰冻方法切片时间比较Tab.1 Comparison of section time between two methods

2 有“冰垫”法冰冻切片优良率较高

对比观察两组冰冻切片的染色情况可见，大部分无“冰垫”法的组织切片中形成冰晶，出现少量不规则腔隙，细胞核被挤压，组织结构稍变形，而有“冰垫”法切片中极少形成冰晶，组织结构完整（图1）。统计学分析发现，有“冰垫”法组织有无裂隙、冰晶形成情况、组织结构清晰度3项指标得分均高于无“冰垫”法（表2）。此外，有“冰垫”法的切片染色优良率为 88.33%（53/60）也明显高于无“冰垫”法的 55.00%（33/60，P= 0.007）（表3）。

表2 两种方法切片质量评分比较Tab.2 Comparison of section quality scores between two methods

3 两种方法免疫组织化学染色效果无差异

对比两种方法制备切片的免疫组织化学染色效果显示：甲状腺组织中的BRAF V600E、乳腺组织中的HER-2和肺组织中的Ki-67等抗原的免疫组织化学染色强度和定位在两种方法之间均无明显差异（图2）。

讨论

冰冻切片技术目前已成为病理科的一项常规工作，在病理诊断工作中发挥着不可忽视的作用[3]。其原理是利用物理降温的方法，在-25℃的低温条件下，短时间内将组织冷冻成硬块后进行切片的一种常规技术方法[4]。冰冻切片可对手术过程中送检的组织做出精准的诊断，为临床手术医师术中手术方案的制定提供重要的判断依据。日常工作中都是要求术中冰冻报告在30 min之内发出。因此，在保证切片质量的前提下，尽量缩短切片时间，可减少术中患者的麻醉时间和临床医生的术中等待时间，具有重要的临床价值。本实验通过比较发现，与普通冷冻法相比，使用“冰垫”进行包埋切片，可大大缩短冰冻制片时间，具有重要的临床意义。

众所周知，减少冰晶形成是冰冻切片质量控制中的关键环节。组织冷冻速度缓慢，耗时长，就容易产生细胞内外的冰晶，出现组织细胞的空核、间质疏松等假象，严重者可以导致细胞和组织结构形态变化，进而不利于术中病理诊断[5,6]。前期有研究表明，采用梯度蔗糖溶液预处理组织后冷冻可有效减少冰晶的形成[7]，但其应用于脑组织时效果并不理想[8]，并且使用蔗糖脱水法耗时较长，无法满足术中快速的时间需求。由此可见，快速冷冻是减少冰冻切片中冰晶形成的主要解决办法。本实验通过比较发现，与普通冷冻法相比，使用“冰垫”可起到速冻的效果，从而有效减少冰晶的产生，且大大提高了制片质量。同时，与无“冰垫”组相比，采用“冰垫”进行冰冻切片不影响免疫组化指标的表达情况。然而，使用冰冻剩余组织进行免疫组化检测时，前期的低温冷冻处理是否对各项指标的特异性和敏感性产生影响，还有待进一步地研究。

除此之外，使用“冰垫”进行包埋时还具有以下优点：首先，在术中快速冰冻制片过程中，将新鲜组织放置在带有“冰垫”的样品托上，再滴加胶水，由于“冰垫”的粘附作用，使得包埋剂不容易外溢，更利于样品托牢牢卡在冰冻切片机的样品头上。其次，对于术中送检的微小组织，例如支气管切缘、脉管切缘和细小淋巴结等，将微小组织放置在“冰垫”上再滴加胶水，可有效防止组织冷冻过程中下沉到样品托的底部，从而使切片时样本托和刀座间保持有足够的距离，防止损伤切片机和减轻技术员切片时的心理压力。另外，对于临床送检皮肤切缘或囊性组织，通常要求立埋，使用冰垫可以防止组织在冷冻过程中的倾斜，从而达到立埋的效果。

在制作“冰垫”的过程中应注意：首先，样品托需要在常温下滴加胶水，再放置于冰冻切片机中，使用冰锤制作“冰垫”，不建议在预冷的样品托上滴加胶水制作“冰垫”，因为后者容易导致切片过程中出现组织脱落的风险，我们推测可能和空气热胀冷缩的原理有关系。其次，在制作“冰垫”时，样本托上滴加的胶水不易过多，防止胶水外溢而不利于样本托固定在冰冻切片机的样本头上。

总之，术中冰冻制片过程中，由于冷冻过慢等原因造成冰晶形成及组织裂隙的产生严重影响冰冻切片的质量及术中快速诊断的准确性。本研究发现使用“冰垫”能大大缩短冰冻制片时间，有效减少冰晶的形成，并提高冰冻制片的质量。该方法操作简便且不需要特殊设备，值得在日常的冰冻制片过程中推广使用。