晾晒、添加物及不同温度对象草青贮发酵品质和微生物的影响

田静，尹祥，樊杨，李鑫琴，张建国

（华南农业大学南方草业中心，广东 广州 510642）

象草（Pennisetum purpureum）是热带、亚热带地区广泛栽培的牧草，具有栽培成本低、产量高、营养价值较高等特点［1］，但其生长具有季节性，且调制干草较为困难，因此，象草常被调制成青贮饲料以保障反刍动物饲料的常年供应［2-3］。一般象草收获时水分含量（80%~84%）和缓冲能力较强，青贮饲料的生产受到限制［4］。高水分含量会导致青贮发酵不良和可溶性营养成分损失［5］，通过晾晒或添加吸附材料增加原材料的干物质含量，或添加糖源增加水溶性碳水化合物以改善其发酵品质［6］。除此之外，青贮饲料的发酵品质可能会受环境温度的影响［7］。有研究报道，20~30 ℃下青贮饲料的主要发酵产物是乳酸［8］，而高于30 ℃青贮饲料的主要发酵产物是乙酸［8-9］。在青贮初期，植物体不断呼吸和有氧微生物活动可能使温度升至40 ℃或更高，导致青贮期间产生大量乙酸、丁酸和酒精［10］。因此，有必要采取适当措施改善温度对象草青贮发酵的影响，从而为农户带来益处。

近几年，随着高通量测序的发展，关于不同温度下青贮饲料微生物群落的研究日益增多［11-12］。Li 等［7］研究表明乳杆菌属（Lactobacillus）和肠杆菌属（Enterobacter）可能是引起热带青贮饲料产生乙酸的主要原因。而Zhang等［13］在40 ℃条件下青贮苜蓿（Medicago sativa），硫酸盐还原菌属（Garciella）是优势菌属。不同的温度条件和原材料本身附着的微生物可能也会影响青贮饲料中的微生物，从而影响发酵过程［14］。然而，有关温度对象草青贮发酵品质和微生物的影响以及如何改善的研究较少，了解细菌多样性可能有助于了解独特的发酵条件并改善象草的青贮饲料质量。

因此，本试验通过将象草晾晒，或不晾晒直接添加玉米粉或蔗糖，再分别置于20、30 和40 ℃的环境下青贮，探究晾晒和添加物处理下环境温度对象草青贮发酵品质与微生物的影响，为提高象草发酵质量提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 象草种植与试验设计

试验所用象草于2020 年8 月在华南农业大学第五教学试验田收获。收回实验室后用铡草机切割，长度为1~2 cm，将切碎的象草混合均匀。一部分放置室外晾晒（WS），另一部分不晾晒，设置为无任何处理（对照，CK）、添加鲜草10%的玉米粉（CS）或2%的蔗糖（SS），其中，玉米粉干物质（dry matter，DM）含量为93.79%，粗蛋白（crude protein，CP）含量为10.22% DM，中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量分别为8.44% DM 和5.00% DM，可溶性碳水化合物（water-soluble carbohydrate，WSC）含量为20.41% DM。然后将晾晒和添加物处理的象草分别混合均匀后装至20 cm×30 cm 的聚乙烯塑料袋中，每袋约200 g，每个处理9 个重复，用真空封口机抽真空密封保存，最后分别放置于20、30 和40 ℃的恒温培养箱中贮藏，即4 个处理×3 个温度×3 个重复，共36 袋。60 d 后开袋取样分析，检测其青贮饲料的发酵品质、微生物数量和细菌多样性。

1.2 试验指标测定

1.2.1原材料营养成分及缓冲能的测定 取20 g 样品，加入80 mL 蒸馏水，使样品完全浸没，放置4 ℃冰箱18 h 后，用中性滤纸过滤，得到浸提液，采用Mettler Toledo FE28 pH 计测定pH；采用盐酸、氢氧化钠滴定法测定缓冲能［15］。再取约150 g 样品，称重后置于70 ℃恒温烘箱中，烘干至恒重称重测定干物质含量；粉碎过1.0 cm 筛，用于测定营养成分，采用凯氏定氮法测定粗蛋白［16］含量；粗纤维（crude fiber，CF）、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量在范氏法（van Soest）的基础上使用改进的滤袋分析法［17］（ANKOM A200i，北京）；可溶性碳水化合物含量采用硫酸-蒽酮法测定［18］。

1.2.2发酵品质和产气的测定 青贮开袋前，采用排水法测定青贮饲料的产气量。开袋后，用1.2.1 中的方法测定pH；采用凯氏定氮法测定氨态氮（ammonia nitrogen，NH3-N）含量；将2 mL 浸提液12000 r·min-1在4 ℃离心3 min，用0.45 μm 的微孔滤膜过滤后，用岛津LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本东京）分析有机酸含量。色谱条件：色谱柱为Eleven Organic Acids on Transgenomic COREGel 87H3；检测器：RID-10A；流动相：0.1 mmol·L-1的磷酸溶液；流速：1 mL·min-1；柱温40 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。

1.2.3微生物计数及测序 无菌操作下称取20 g 样品，加入90 mL 无菌水，在200 r·min-1摇床中振荡30 min。吸取1 mL 稀释至不同浓度后，分别采用MRS 琼脂培养基（MRS agar medium，MRS）［酪蛋白酶消化物10 g·L-1，牛肉膏粉10 g·L-1，酵母膏粉4 g·L-1，柠檬酸三铵2 g·L-1，乙酸钠5 g·L-1，硫酸镁0.2 g·L-1，硫酸锰0.05 g·L-1，磷酸氢二钾2 g·L-1，葡糖糖20 g·L-1，吐温-80 1.08 g·L-1，琼脂15 g·L-1］、营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）［蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏粉3 g·L-1，氯化钠5 g·L-1，琼脂15 g·L-1］、孟加拉红培养基（rose bengal agar，RBA）［蛋白胨5 g·L-1，葡糖糖10 g·L-1，磷酸二氢钾1 g·L-1，硫酸镁0.5 g·L-1，琼脂15 g·L-1，孟加拉红0.033 g·L-1，氯霉素0.1 g·L-1］和亚硫酸铁琼脂培养基（iron sulfite agar，ISA）［胰蛋白胨15 g·L-1，大豆蛋白胨5 g·L-1，酵母浸膏5 g·L-1，偏重亚硫酸钠1 g·L-1，枸橼酸铁铵1 g·L-1，琼脂15 g·L-1］进行乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）、好氧性细菌、酵母菌、霉菌和梭菌划板培养后计数。LAB 和梭菌用厌氧罐37 ℃培养1~2 d；好氧性细菌、酵母菌和霉菌在有氧条件下30 ℃培养2~3 d。

称取的分析样品添加至20 倍体积灭菌的磷酸盐缓冲液（pH=7.4）中进行DNA 提取，再通过聚合酶链式反应（PCR，95 ℃持续2 min，然后在95 ℃持续30 s，55 ℃持续30 s，72 ℃的25 个循环）进行扩增细菌16S 核糖体RNA基 因 的V3~V4 区 域，引 物 为338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTW TCTAAT），进行30 s 的扩增［7］，最后在72 ℃延伸5 min。最后将PCR 产物在Illumina MiSeq 平台上测序，使用Trimmomatic v0.33 软件，对测序得到的Raw Reads 进行过滤；然后用Cutadapt 1.9.1 软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量Reads，再拼接序列即Clean Reads，使用UCHIME v4.2 软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。使用QIIME 2 软件，对样品Alpha 多样性指数进行评估。

1.3 数据统计

微生物数量的计数转换为log10cfu·g-1FM。采用SPSS 19.0 进行独立样本T检验，分析晾晒对青贮前原材料的化学特性和微生物数量的影响，用双因素方差分析和Duncan 法对晾晒、添加物和温度处理下象草青贮后发酵品质进行多重比较，P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 象草青贮前的特性

象草原料特性如表1 所示。象草原材料的DM 含量约17%，晾晒后增加至约25%，晾晒处理显著（P<0.05）增加了象草的pH、缓冲能和除梭菌外的其他微生物数量，显著降低了WSC 含量。

表1 象草晾晒前后的化学特性和微生物数量Table 1 The characteristic and microbial composition of fresh and wilting napier grass

2.2 象草青贮的发酵品质

由表2 可知，青贮60 d 后，对照在30 ℃下的青贮饲料的DM 和乳酸含量显著高于20 ℃（P<0.05），且40 ℃下的乙酸含量最高，温度对其pH 无显著影响（P>0.05）。原材料晾晒后，所有温度下青贮料的pH 提高，乳酸含量降低，尤在30 ℃，发酵品质最差，表现为pH、乙酸、丁酸和NH3-N 含量最高，乳酸含量最低（P<0.05）。20 和40 ℃条件下，虽晾晒后pH 高于对照，但降低了丁酸和NH3-N 含量。添加10%玉米粉后，与对照相比，每个温度下的pH 均降低，30 ℃的pH 下降最显著（P<0.05），但有机酸含量均有所降低，同时，20 和40 ℃下的NH3-N 含量降低，但30 ℃下增加。添加2%蔗糖后的pH 显著低于对照和除40 ℃的添加玉米粉处理（P<0.05），同时，乳酸含量也较高，乙酸、丁酸和NH3-N 含量降低。方差分析结果表明，温度除对DM 无显著影响，NH3-N 显著影响（P<0.05）外，对其他指标均有极显著影响（P<0.01），晾晒和添加物处理对所有指标均有极显著影响（P<0.01），二者的交互作用对pH、乳酸、乙酸和丁酸含量均有极显著影响（P<0.01）。

表2 不同处理下青贮象草的发酵品质比较Table 2 The fermentation quality comparison of napier grass silage at different treatments

所有在20 ℃下发酵的青贮饲料中，LAB 和好氧细菌数量最多，且随温度升高而下降，晾晒处理在每个温度下均增加了LAB 和好氧细菌数量，而添加玉米粉和蔗糖则降低了其数量，尤其在40 ℃时，效果最显著（P<0.05）。所有青贮饲料的酵母和霉菌均低于2 log10cfu·g-1FM。方差分析结果表明，温度、晾晒和添加物处理及两者交互作用对LAB 数量均有极显著影响（P<0.001，表3）。

表3 晾晒、添加物和贮藏温度对青贮象草微生物数量的影响Table 3 Effects of wilting，additives and storage temperature on microbial composition of napier grass silage in 60 days

由图1 可知，对照、添加玉米粉和蔗糖的青贮饲料在20 ℃下发酵的产气量均高于30 和40 ℃，但除对照在20 ℃显著高于40 ℃外，其余差异不显著，而晾晒处理后，20 和30 ℃条件下的青贮饲料的产气量相当，均显著高于40 ℃和其他处理（P<0.05）。40 ℃下各处理间青贮饲料的产气量差异不显著（P>0.05）。

图1 象草青贮的产气量Fig.1 Gas production of napier grass silage in 60 days

2.3 象草青贮的细菌群落

通过16S rRNA 基因扩增子的高通量测序，共获得2239912 个细菌序列（每个样品约158282 个有效序列）。经过生物信息学分析，如表4 所示，这些序列共聚类7582 个可操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）。每个样本的OTUs 从334 到771 不等，其中，新鲜象草的最多（771）。用来评估细菌多样性的Chao 1 指 数，Simpson 和Shannon 指 数 显 示 出 与OTUs 相似的趋势，均是新鲜象草的细菌丰度高，晾晒后降低。所有处理在40 ℃条件下发酵的青贮饲料的Chao 1、Simpson 和Shannon 指数基本上均高于20 和30 ℃。所有样品的覆盖度均为0.99，表明大多数细菌群落被检测出。

表4 新鲜象草和青贮饲料的细菌群落多样性统计Table 4 Diversity statistics of bacterial community of fresh napier grass and its silage

图2显示了象草青贮前后在科属水平上的细菌群落的差异。新鲜象草中主要以变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）为主，分别占40% 和29%，晾晒后变形菌门增加至90%，主要是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的肠杆菌属（Enterobacter）和泛菌属（Pantoea），分别占27%和47%。与LAB 相关的乳球菌属（Lactococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和魏斯氏菌属（Weissella）的相对丰度下降。青贮后，饲料中主要由肠杆菌科的肠杆菌属和链球菌科（Streptococcaceae）的乳球菌属细菌代替。其中，20 ℃下发酵的所有青贮饲料中，肠杆菌属和乳球菌属丰度均高于30 和40 ℃，且除晾晒处理30 ℃下肠杆菌属丰度最低外，对照和添加物处理均是40 ℃下的丰度最低。在晾晒后20 和30 ℃青贮时，肠球菌属丰度约15%，高于40 ℃。肠杆菌属丰度在20 ℃下添加玉米粉处理发酵时丰度最高，达到近55%，乳球菌属丰度在20 ℃下添加蔗糖时最高，达到近38%，而乳杆菌属丰度在对照30 ℃和添加蔗糖20 ℃条件下较高，约为4.1%，稍高于青贮前的新鲜象草。

图2 象草青贮前和青贮后的科（a）和属（b）水平的细菌多样性Fig.2 Family-（a）and genus-（b）level microbiota analysis of fresh napier grass and its silage

3 讨论

3.1 象草青贮前的化学特性

本试验中新鲜象草的CP 含量较高，为11.35% DM，高于Yin 等［19］和Tao 等［20］报道的10.41% DM 和6.42%DM，低于Gulfam 等［14］报道的12.7% DM。WSC 含量（6.96% DM）高于Yin 等［19］和Gulfam 等［14］的结果，满足优质青贮饲料制作所需的6%~7% DM［21］。原材料营养成分含量的不同，可能是由于不同地理位置以及生长收获期等因素影响［22］。晾晒处理显著提高了象草的DM，降低了WSC 含量，对CP、NDF 和ADF 含量无显著影响，这一结果与Yin 等［19］报道的一致。新鲜象草中的LAB 数量（4.21 log10cfu·g-1FM）没达到5 log10cfu·g-1FM 优良青贮饲料的最低要求［3］，而晾晒处理显著增加了LAB 数量（7.36 log10cfu·g-1FM），但好氧细菌、酵母和霉菌数量也显著增加，好氧细菌数量高达8.74 log10cfu·g-1FM，可能会影响象草的青贮发酵品质。

3.2 象草青贮的发酵品质和微生物多样性

青贮饲料的pH、有机酸和NH3-N 是衡量青贮饲料发酵品质的重要指标。当青贮饲料pH 低于4.2 时，往往青贮发酵效果较好，而pH 高于4.2 表明发酵品质较差。本试验中晾晒处理在3 个温度下的pH 均高于5.0，对照和添加玉米粉处理的pH 均是在30 ℃条件下最低（4.28 和4.14）、20 ℃条件下最高（4.37 和4.24），添加蔗糖处理的青贮饲料pH 值均低于4.2，由此可见添加蔗糖对其青贮品质效果较好。

环境温度影响青贮料的发酵品质，有研究报道大麦（Hordeum vulgare）秸秆［23］和柱花草（Stylosanthes guianensias）［24］在30 ℃条件下的青贮饲料比20 ℃青贮产生较少的乳酸，较多的乙酸。苜蓿［25］、小麦（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays）等［26］在约40 ℃条件下发酵比低温下青贮产生较少的有机酸，较高的pH 和NH3-N 含量。然而本研究发现，对照和添加玉米粉的象草在不同温度下青贮对pH 的影响不显著。添加蔗糖后，20 ℃保存的青贮料pH 显著低于40 ℃的青贮饲料，且均与30 ℃青贮饲料的pH 无显著差异，而晾晒后，30 ℃保存的青贮饲料pH 达到5.85，20 和40 ℃条件下pH 为5.5 以下，表明晾晒后的象草在30 ℃青贮时发酵较差，而对照和添加物处理在30 ℃的发酵与20 和40 ℃差异不显著。原因可能是晾晒时空气湿度大，原材料的水分含量高，下降缓慢，好氧细菌等有害微生物增多，消耗了较多的WSC，本试验中晾晒只降低了10 个百分点的水分，未将水分降低至65%以下，因此，晾晒后象草的发酵品质未能改善，反而变差，且30 ℃时发酵最差。因为与20 和40 ℃相比，30 ℃条件下青贮需要更高含量的WSC 来限制丁酸发酵［27］，且Yang 等［28］曾报道只有当葡萄糖添加率超过7.0% DM时，LAB 在30 ℃的小麦秸秆青贮饲料中才能占主导地位。与对照相比，添加玉米粉后的青贮饲料的pH 和NH3-N含量降低，乳酸含量升高，但效果不显著，而添加蔗糖的效果显著（P<0.05）。原因可能是加糖处理可为LAB 提供充足的底物，相对较低的pH 抑制了有害微生物的生长，使蛋白组分得到了较好的保存，故NH3-N 含量较低。有研究报道高温（约40 ℃）通常会促进蛋白水解，从而对发酵产生不利影响，加剧NH3-N 和丁酸的产生。而本研究结果表明高温对NH3-N 没有显著影响，只是晾晒处理的青贮饲料的丁酸含量有增加趋势，原因可能是高温下乙酸含量的增加抑制了一些蛋白水解微生物［26］。LAB 和好氧细菌数量在添加物处理后的每个温度下均出现下降，且随温度的增加而降低，Li 等［7］也报道了高温（40 ℃）会显著抑制LAB 的生长。

Li 等［7］报道乙酸是热带地区牧草青贮产生的主要有机酸且随青贮时间延长乙酸水平上升。而在本研究中除晾晒处理在30 ℃青贮时，乳酸与乙酸含量类似外，象草均以乳酸发酵为主，可能是因为象草表面原附着的菌群和环境条件影响到青贮饲料发酵所涉及的微生物生理和代谢［27］。除晾晒外的其他青贮饲料随青贮温度的增加，乙酸含量增加。这与Wang 等［25］的研究结果相一致，可能归因于高温抑制了产乳酸细菌（如乳杆菌属）的代谢［13］，而低温未抑制肠杆菌属和异型发酵LAB（如乳球菌属）等的生长。本研究的细菌多样性也表明肠杆菌属和乳球菌属的相对丰度在20 ℃青贮时最高，且晾晒后在20 和30 ℃保存的青贮饲料的肠球菌属丰度显著高于40 ℃。Chen等［29］的研究结果也表明青贮过程中产生的CO2与乳球菌属、明串珠菌属（Leuconostoc）等呈正相关，与沙雷氏菌属（Serratia）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）和片球菌属（Pediococcus）呈负相关（P<0.05）。因此，本研究中肠杆菌、乳球菌和肠球菌属可能是导致20 ℃下青贮饲料的产气量高于30 和40 ℃以及晾晒处理在20 和30 ℃青贮时产气量均较高的原因。

4 结论

在本研究中，新鲜象草的对照、添加玉米粉或蔗糖处理发酵品质均在30 ℃条件下较好，乳酸含量较高，其中添加蔗糖效果最好；随青贮温度升高，乙酸的含量趋于增加。晾晒虽增加了象草的DM 含量，但显著降低其WSC含量，导致乳酸含量下降、青贮发酵品质变差，特别是30 ℃条件下青贮发酵品质最差。晾晒后在20 和30 ℃时青贮，产气量显著高于其他处理。象草青贮前的细菌多样性较丰富，青贮后主要是肠杆菌属和乳球菌属，尤其在20 ℃青贮时的相对丰度较高，晾晒后在20 和30 ℃青贮时，肠球菌属的相对丰度高于40 ℃。因此，在华南地区潮湿环境下，相比于晾晒，添加玉米粉或蔗糖对其发酵品质效果更好。