自然感染鸭坦布苏病毒蛋鸭卵巢的病理学观察

张羽晨，雷亚萍，农碧丹，庞晓敏，张苗苗，刘晓丽，谷长勤，张万坡，程国富，胡薛英

(华中农业大学动物医学院，武汉 430070)

自2010年4月以来，我国不同地区陆续暴发了一种以蛋鸭产蛋下降为主要特征的疫病，经病原学诊断为鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTMUV)感染。该病发生迅速、流行范围广、传播速度快、发病率和死亡率都较高，对全国大部分省市蛋鸭养殖业造成了一定的冲击。感染DTMUV后蛋鸭卵泡膜充血、出血，卵巢淋巴细胞浸润，部分病鸭的卵泡膜增厚；攻毒后9 d，从卵泡膜中分离到病毒，推断卵泡膜可能是该病毒的主要靶器官。虽然对感染DTMUV后鸭各器官的组织病理学变化进行了相关研究，但有关蛋鸭感染DTMUV后卵巢各级卵泡的病理损伤、损伤与病毒分布的关系研究并不多。本研究对自然感染DTMUV病鸭的临床症状、剖检病变、组织病理学变化及病毒抗原定位进行观察研究，旨在进一步探究DTMUV感染卵巢的病理损伤特点，为DTMUV感染蛋鸭导致产蛋下降致病机制的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

湖北省某蛋鸭场送检病鸭，鸭场此前未免疫过DTMUV疫苗。

主要试剂及设备：鼠抗鸭坦布苏病毒单克隆抗体(华中农业大学动物医学院罗锐副教授惠赠)，黑色素A(Melan-A)抗体(A103)、广谱细胞角蛋白(pan cytokeratin, PCK)抗体(PCK-26)、HRP标记的羊抗鼠/兔IgG均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；封闭液(5%BSA)和显色液(DAB)购于武汉博士德生物技术有限公司；M-MLV反转录试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；GoldView为济南庄盟生物技术有限公司产品；Nikon80i生物光学显微镜为上海横桥仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 病鸭的临床症状观察和剖检 观察感染病鸭的临床症状，剖检并观察大体病变，取部分病鸭的脑组织置于-80 ℃冰箱保存，用于病毒检测鉴定，部分病鸭的卵巢组织于4%多聚甲醛固定液内固定。

1.2.2 病毒的检测及鉴定 按照参考文献[6]设计引物，上游引物：5′-GCCACGGAATTAGCGGTTGT-3′,下游引物：5′-TAATCCTCCATCTCAGC GGTGTAG-3′,目的片段碱基数为300 bp(由生工武汉技术部合成)，使用前瞬时离心后用适量无菌三蒸水溶解，小量分装，-20 ℃保存备用。取病鸭脑组织研磨成匀浆，参考北京全式金生物技术有限公司的EasyPureViralDNA/RNAKit试剂盒说明书提取含有病毒RNA的溶液，用M-MLV反转录试剂进行cDNA的合成，参照文献[4]中的方法进行病毒特异性序列的扩增，反应结束后，取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统拍照分析。

1.2.3 卵巢的组织病理学观察 卵巢组织经固定液固定48 h后，常规石蜡包埋，连续切片，厚度4 μm， 1张进行HE染色，3张做免疫组织化学染色备用。利用Nikon80i生物光学显微镜与NIS-Elements高清晰度彩色图文分析系统进行结果观察与记录。

1.2.4 免疫组织化学染色 本试验免疫组织化学染色的步骤按照文献[7]进行。其中，第一抗体工作浓度、修复液及修复方法见表1。

表1 免疫组织化学方法概括Table 1 Summary of immunohistochemical methodology

2 结 果

2.1 自然感染DTMUV病鸭的临床症状

感染DTMUV病鸭主要表现为产蛋量急剧下降，产蛋率从90%左右下降到20%或10%，有些病鸭表现精神沉郁，站立不稳，采食量下降，并伴有头部振颤、两腿呈游泳状挣扎等明显神经症状(图1)。严重病例痉挛倒地不起，两腿向后踢蹬呈角弓反张，最后衰竭死亡。

图1 自然感染鸭坦布苏病毒病鸭的临床症状Fig.1 The clinical manifestations of ducks naturally infected with duck tembusu virus

2.2 自然感染病鸭卵巢的剖检病变

卵巢是发病蛋鸭的主要病变器官，有的病鸭生长卵泡数量减少，成熟卵泡卵泡膜可见红色、暗红色斑块，个别卵泡外观呈灰白色胶冻状，部分成熟卵泡表面淤血(图2A)；有的病鸭成熟卵泡数量减少，滤泡网血管扩张，整体呈暗红色；输卵管表面呈暗红色(图2B)；部分病鸭卵泡破裂，卵黄溢出并引起卵黄性腹膜炎，剖检病鸭输卵管内均未见蛋的生成(图2C)。

A. 成熟卵泡卵泡膜可见大小不一的暗红色斑块；B. 成熟卵泡呈暗红色，数量减少；C. 卵泡表面可见暗红色斑块，有卵泡破裂A. Dark red patches of different sizes can be seen on the follicular membrane of mature follicles; B. Mature follicles are dark red and the number is reduced; C. Dark red patches can be seen on the surface of follicles, with ruptured follicles图2 自然感染病鸭卵巢的病理学变化Fig.2 Gross appearance of ovary from the ducks naturally infected with duck tembusu virus

2.3 病毒的检测与鉴定

提取病鸭脑组织内的病毒RNA，用M-MLV反转录试剂进行cDNA的合成，经病毒特异性序列的扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以看出扩增产物的条带大约300 bp，与预期扩增的片段大小一致(图3)

M. DNA相对分子质量标准；N. 阴性对照；P. 阳性对照；1～4. DTMUV特异性序列扩增产物M. DL2000 DNA marker；N. Negative control; P. Positive control; 1-4. DTMUV specific sequence amplification product图3 鸭坦布苏病毒扩增条带的电泳鉴定Fig.3 Electrophoresis results of duck tembusu virus

2.4 病鸭卵巢组织病理学观察

病鸭卵巢的组织病理学观察显示,卵巢表面生殖上皮细胞增生，由一层变为多层(图4A)；卵巢皮质内出现大量的空泡状细胞(图4B)；卵巢皮质内增生的空泡状细胞间有红细胞渗出(图4C)。

A. 卵巢生殖上皮细胞增生(→标注)，Bar=50 μm；B. 卵巢皮质内大量的空泡状细胞(→标注)，Bar=200 μm；C. 卵巢皮质内红细胞渗出(→标注)，Bar=100 μmA. Proliferation of ovarian germ epithelial cells(→labeled), Bar=50 μm; B. A large number of vacuolar cells in the ovarian cortex(→labeled), Bar=200 μm; C. Red blood cell exudation in the ovarian cortex(→labeled), Bar=100 μm图4 病鸭卵巢的组织病理学观察结果Fig.4 Histopathological observation of the ovaries of sick ducks

病鸭卵巢的原始卵泡未见损伤(图5A)；可见有些生长卵泡颗粒细胞凋亡，细胞膜完整，细胞固缩红染(图5B)，部分卵泡颗粒细胞大量增生(图5C)；成熟卵泡生殖上皮细胞增生肿胀(图5D)，卵泡外膜有大量空泡状细胞增生(图5E)，卵泡内膜纤维化(图5F)，颗粒细胞空泡化，并伴有大量的异嗜性粒细胞浸润(图5G)，卵黄膜增生并脱落至卵泡腔内(图5H)；部分卵泡周围大量结缔组织和动脉增生，增生的动脉壁平滑肌细胞坏死并见大量炎性细胞浸润(图5I)。

A. 原始卵泡无明显损伤，Bar=100 μm；B. 颗粒细胞凋亡(→标注)，Bar=50 μm；C. 颗粒细胞增生(→标注)，Bar=50 μm；D. 卵泡生殖上皮细胞增生肿胀(→标注)，Bar=50 μm；E. 卵泡周围空泡状细胞增生(→标注)，Bar=100 μm；F. 卵泡内膜纤维化(→标注)，Bar=50 μm；G. 成熟卵泡颗粒细胞空泡化(→标注)，Bar=50 μm；H.卵黄膜增生(→标注)，Bar=5 0 μm；I. 动脉平滑肌坏死，有大量的炎性细胞浸润(→标注)，Bar=50 μmA. No obvious damage to primordial follicles, Bar=100 μm; B. Apoptosis of granulosa cells(→labeled), Bar=50 μm; C. Hyperplasia of granulosa cells(→labeled), Bar=50 μm; D. Proliferation and swelling of germ epithelial cells(→labeled), Bar=50 μm; E. Increased stromal cells in follicles(→labeled), Bar=50 μm; F. Fibrosis of follicular inner membrane(→labeled), Bar=50 μm; G. Mature follicular granulosa cells are vacuolated(→labeled), Bar=50 μm; H. Vitelline membrane hyperplasia(→labeled), Bar=50 μm; I. Arterial smooth muscle fibrosi(→labeled), Bar=50 μm图5 病鸭卵泡的组织病理学观察结果Fig.5 Histopathological observation of the follicles of sick ducks

2.5 病鸭卵巢的免疫组织化学染色

病鸭卵巢的IHC结果显示，分布于卵巢表面的生殖上皮细胞PCK表达阳性(图6A)，卵泡周围增生的大量空泡状细胞中PCK呈阳性表达(图6B)；Melan-A的染色结果显示，生长卵泡和成熟卵泡的颗粒细胞呈阳性表达(图6C)，卵泡膜细胞和生殖上皮细胞呈阴性；DTMUV的染色结果显示，卵泡中颗粒细胞表达阳性，卵泡膜细胞和生殖上皮细胞表达阴性(图6D)。

A.卵巢生殖上皮细胞PCK呈阳性反应(→标注)，Bar=50 μm；B.卵泡周围增生的空泡状细胞PCK呈阳性反应(→标注)，Bar=100 μm；C.卵泡颗粒细胞Melan-A呈阳性表达(→标注)，Bar=50 μm；D：卵泡颗粒细胞DTMUV呈阳性表达(→标注)，Bar=50 μmA. Ovarian germ epithelial cells PCK positive(→labeled), Bar=50 μm; B. Ovarian mesenchymal cell hyperplasia(→labeled), PCK positive, Bar=100 μm; C. Ovarian granulosa cell Melan-A positive(→labeled), Bar=50 μm; D. Granulosa cell DTMUV positive(→labeled), Bar=50 μm图6 病鸭卵巢的免疫组织化学结果Fig.6 Immunohistochemical results of sick duck ovary

3 讨 论

于春梅等研究表明，攻毒后3 d各组织TMUV的相对表达量都较高，其中，卵泡和输卵管最高；通过试验发现感染DTMUV病鸭剖检可见卵泡充血、出血和液化；组织病理学变化为卵巢组织中异嗜性粒细胞浸润，卵泡颗粒细胞脱离基底膜，随后坏死、崩解，卵黄溶解；王伟等研究发现，鸭腿部肌肉注射DTMUV液11 d后卵巢仍存在萎缩，无正常发育卵泡形成。本研究发现病鸭感染DTMUV后，临床表现病鸭产蛋量明显下降，卵泡充血、出血、液化。组织病理学变化为卵泡的颗粒细胞增生、凋亡和坏死，大量异嗜性粒细胞浸润，这些变化与文献报道一致。

本研究运用免疫组织化学方法，进一步观察了DTMUV在卵巢中的分布，结果显示，DTMUV分布在卵泡的颗粒细胞中。家禽卵巢中有数以千计的卵泡，产蛋期卵巢中存在着大小不等的卵泡，形成了家禽特有的等级卵泡，家禽卵泡发育和等级建立是一个由多因素调控的复杂的生物学过程。颗粒细胞是卵巢的体细胞之一，在卵泡的发育及闭锁中具有重要的作用，颗粒细胞能够产生并分泌孕酮激素，在卵泡结构的膜细胞层转化成雄激素和雌激素，并分泌HDL样颗粒为卵母细胞提供脂质体，为生物膜的合成做准备，对卵母细胞发育起促进作用；张少伟研究提示：随着家禽从未开产期进入开产期，必然会伴随着卵巢体积的增大和重量的增加，卵泡闭锁是造成进入等级的卵泡数量减少、产蛋量下降的主要原因。本研究表明感染DTMUV后生长卵泡和成熟卵泡的颗粒细胞由于DTMUV的侵袭，颗粒细胞增生、凋亡和坏死，引起卵泡闭锁，造成蛋鸭产蛋量下降。

本研究还发现病鸭卵巢的原始卵泡无明显损伤，这印证了感染DTMUV后蛋鸭的产蛋能力恢复的现象，但DTMUV如何侵袭卵泡的颗粒细胞进而损伤卵巢致病机制有待进一步研究。

4 结 论

感染DTMUV后，病鸭卵泡充血、出血、破裂，组织病理学研究发现,病毒主要分布在生长卵泡和成熟卵泡的颗粒细胞，颗粒细胞发生增生、凋亡或坏死。由于颗粒细胞的病变，导致卵泡闭锁，进而引起蛋鸭产蛋量下降。