实验动物小肠结肠炎耶尔森菌的实验室检测能力验证结果评价*

冯育芳 邢 进 王 洪 张雪青 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院 实验动物资源研究所，北京 100050)

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)可产生耐热肠毒素，不能被高温灭菌(121 ℃、30 min)破坏，对酸碱稳定。食用被该菌污染的食物、水，以及与感染动物接触，可导致人兽共患病，甚至造成死亡[1-2]。因此，小肠结肠炎耶尔森菌属于SPF级动物必要时检测项目[3]。为了解和提高实验动物小肠结肠炎耶尔森菌的检测能力，本次能力验证项目依据CNAS-CL03《能力验证提供者认可准则》进行检测能力验证(NIFDC-PT-173)，以期对提升实验动物小肠结肠炎耶尔森菌的检测能力[4]提供参考，同时对实验动物微生物检测能力验证计划的实施提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：SPF级雌性豚鼠2只，8周龄，由中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供【SYXK(京)2017-0012】，实验动物福利伦理号：中检动(福)第2021(A)007号。动物粪便采集在生物安全柜内进行。

1.1.2菌株：本研究使用小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica, CMCC52301)，同时设置2个干扰菌；根据细菌形态和特征，选择宋内志贺氏菌(Shigellasonnei, CMCC51082)和大肠埃希氏菌(Escherichiacoli, CMCC44110)。3株菌均购自中国食品药品检定研究院中国医学细菌保藏管理中心，使用前通过BD-Phoniex100细菌鉴定仪进行鉴定。

1.1.3试剂材料：冻干保护液由中国食品药品检定研究院食品化妆品所提供。培养基包括哥伦比亚血琼脂基础(OXIOD公司，CM0331B)、脱纤维羊血(北京陆桥公司，P62)、CIN-1培养基(海博生物，HB0269)和改良Y培养基(海博生物，HB0270)；生化鉴定试剂为BD阴性菌鉴定板(BD公司，448007)。

1.2 方法

1.2.1质控样品制备：复苏小肠结肠炎耶尔森菌、宋内志贺氏菌和大肠杆菌，在哥伦比亚血琼脂培养基进行传代，25 ℃培养48 h后分别用PBS调成109CFU/mL的菌悬液备用。将80%的冻干保护液、10%的SPF豚鼠粪便(高压灭菌后)和10%的菌悬液(109CFU/mL)震荡混匀制成混悬液，细菌终浓度为108CFU/mL，将3种混悬液进行分装(200 μL/管)，用冷冻干燥机制成冻干样品。样品采用大流水方式进行编号。

1.2.2质控样品均匀性试验：在3种样品中分别随机抽取10管样品，用200 μL灭菌水重悬，10倍系列稀释至102CFU/mL，将102～104CFU/mL浓度的菌液接种改良Y琼脂，25 ℃培养48 h后进行菌落计数，菌液浓度相差应低于100倍，即原始菌液浓度应在106～108CFU/mL之间。

1.2.3质控样品稳定性试验：本次能力验证的3种质控样品进行稳定性检验，首先对贮藏稳定性进行检验，于-20 ℃、4℃、25 ℃、37 ℃保存。-20 ℃于0 、30 d时取样，4 ℃于0、14、21、28 d取样(25±1)℃、37 ℃于0～10 d每天取样，参照作业指导书对上述抽取样品进行检验。用200 μL灭菌水重悬将菌液接种改良Y琼脂，25 ℃培养48 h，3种样品可分别检测出相应的细菌。同时对运输稳定性进行检验，选取不同温度条件的城市，将样品完全按照实际运输要求进行包装，分别寄往相应城市后再寄回，应能检出相应细菌。

1.2.4参加实验室：全国共24家实验室参加了此次能力验证计划，地区分布见表1。

表1 参加实验室地区分布Table 1 Local distribution of Laboratory

1.2.5检测方法：本次能力验证建议参考GB/T 14926.3—2001实验动物耶尔森菌检测方法。不局限于国标规定检测方法，但要求提供原始记录，并要求含有具体检测信息。

1.2.6结果判定标准：3种样品中1个为小肠结肠炎耶尔森菌阳性，2个为小肠结肠炎耶尔森菌阴性。实验室结果与上述结果完全一致，即判定为满意结果；实验室结果与上述结果不一致，即判定为不满意结果；未按时反馈结果，也判定为不满意结果。

2 结果

2.1 质控样品均匀性试验

随机选取10套样品用于均匀性验证，所有样品在相同环境下对所含细菌数量进行平板计数测定。3种样品测定结果为：CMCC52301浓度 8.99×107～3.48×108CFU/mL，CMCC51082浓度 9.20×107～3.98×108CFU/mL。CMCC44110浓度 7.65×107～2.98×108CFU/mL。表明本次能力验证所制备的样品是均匀的。

2.2 质控样品稳定性试验

按照1.2.3的方法对所制备的能力验证样品进行温度和运输稳定性测试，4 ℃存储4周，室温(25±1)℃和37 ℃放置10 d，3种样品均能检出相应细菌。运输稳定性检验证实样品可以满足运输要求，并保持细菌活性。存放稳定性和运输稳定性结果证明了所制备能力验证样品的稳定性达到发放要求。

2.3 实验室反馈

参加此次比对共24个实验室，22家满意，占实验室总数的91.7%；2家不满意，占实验室总数的8.3%，其中1家未及时反馈结果，另一家将小肠结肠炎耶尔森菌阴性样品检测为阳性。本次能力验证不公布具体实验室名称，仅以实验室代码进行统计，具体结果见表2。

表2 实验动物小肠结肠炎耶尔森菌检出能力验证结果汇总Table 2 The summarizing of the detection levels of experimental animal Yersiniaenterocolitica testing results

3 讨论

CNAS-RL01: 2018《实验室认可规则》、CNAS-RL02: 2018《能力验证规则》规定申请认可和获准认可的实验室必须通过参加能力验证活动(包括CNAS组织实施或承认的能力验证计划、测量审核)证明其技术能力。只有在能力验证活动中表现满意，或对于不满意结果能证明已开展了有效纠正措施的实验室，CNAS方可受理认可申请或予以认可。对参加了CNAS组织及其承认的能力验证活动且有稳定满意表现的实验室，在CNAS的各类评审中可考虑适当简化相关项目的能力确认过程。实验室应保存上述记录以备评审组检查。

能力验证是实验室检测质量监控的重要手段，既是实验室内部质量控制的补充，又是政府和社会了解实验室检测能力的重要方法[5]。能力验证作为日常监督检查的辅助手段，能够有效提升实验室的检测能力。促进实验室保持有效的检测能力，同时也帮助部分实验室及时发现自身的不足并加以改进，为更好地检测实验动物提供有力的技术支撑[6-7]。本项目研究，包括小肠结肠炎耶尔森菌能力验证样品的制备、评价方案的制定以及能力验证结果的汇总分析，评价参加单位实验动物致病菌的检测能力，验证计划的组织和实施工作。

根据实验动物国家标准，小肠结肠炎耶尔森菌的检测程序为：无菌操作下取回盲部内容物、粪便或肛拭子，接种于CIN-1或改良Y琼脂平皿，置25 ℃培养48 h，观察平皿上是否有边缘半透明或透明，中心呈深红色，表面湿润突起的“牛眼状”菌落，如有可疑菌落，需要纯培养后进行生化鉴定，生化鉴定可以选择全自动细菌鉴定仪，也可以选择生化条，或者根据国标中的生化项目进行检测均可以得出准确的结论。

从NIFDC-PT-173实验动物肠道中小肠结肠炎耶尔森菌检测能力验证计划结果报告中可以看出，本次能力验证计划参加实验室共有24家，其中23家实验室在规定时间内提交了结果反馈单，1家没有及时提交结果反馈单。其中判定为满意结果的有22家，占91.7%，不满意结果有2家，占8.3%。实验动物质量检测机构对小肠结肠炎耶尔森菌的检测能力很高。本次能力验证不规定检测方法，参加单位中有6家采用了不止2种检测方法，有2家单位使用了PCR方法进行检测并准确的检测出小肠结肠炎耶尔森菌，20家均采用了生化鉴定法，实验室449未及时反馈结果，判为不满意，实验室887将阴性样本检测为阳性，判为不满意，查验了该单位的检测报告，考虑可能是因为初次接种样本时污染或接错等导致鉴定结果不准确。

本次能力验证活动采用生化鉴定的单位中有9家没有生化管来源及批号信息，要求检测报告中应含有完整的试剂信息。在参加单位中，有2家单位寄回的纸质材料中没有原始记录，所以无法判断这2家单位用的何种检测方法。除去能力验证的要求，附原始记录对参加单位是有好处的，比如结论填报错误但原始记录结果正确，这种情况会联系该单位要求其改正结论，如果没有原始记录即只能判定该单位结果不满意。

综上所述，本次能力验证的实施有助于实验动物质量检测实验室在小肠结肠炎耶尔森菌检测过程中发现自身的问题，并且针对性的予以解决，达到提高自身检测能力的目的，最终提升实验动物质量水平，保障实验动物和动物实验的安全和效果。