亚胺连接的多孔共价有机骨架材料结合固相萃取-液相色谱-串联质谱检测蜂蜜中雌激素

李 慧, 任耿標, 李慧娟, 陈相峰, 张志国, 赵燕芳*

(1. 齐鲁工业大学(山东省科学院)食品科学与工程学院, 山东 济南 250353;2. 齐鲁工业大学(山东省科学院), 山东省分析测试中心, 山东 济南 250014)

雌激素是一种重要的内分泌干扰化合物[1-3],与人类身体器官的癌变有很大的关系,如乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等[4-7]。近年来,在环境水体、表层沉积物和牛奶中均检测到了雌激素[8-11],蜂蜜中的雌激素可能来自于环境污染和人工添加[12,13]。根据美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)和欧洲食品安全管理局(European Food Safety Authority, EFSA)的规定,蜂蜜中禁止添加雌激素[14]。蜂蜜中的雌激素含量通常较低,检测时会伴有许多干扰物质。但是目前国内并没有相关的标准检测方法,所以需要发展一种简单、灵敏、快速的检测方法,以应对蜂蜜样品中痕量雌激素的检测需求。

目前雌激素常用的分析方法有液相色谱-质谱法(LC-MS)[15-18]和气相色谱-质谱法(GC-MS)[19-21]。样品在色谱或质谱分析之前,需要富集目标物。各种预处理方法中,固相萃取(SPE)技术具有重现性好、回收率高、萃取时间短、有机溶剂消耗量低等优点,被认为是雌激素样品预处理的有效技术[22]。利用聚苯乙烯-二乙烯基苯(HLB)吸附剂萃取蜂蜜中雌激素时,其他杂质成分可能会吸附在HLB吸附剂上,干扰雌激素的富集[18]。这些干扰物的共吸附不仅影响雌激素的保留,还会产生基质效应。因此,通常需要前处理程序来减少基质效应,提高方法精度。共价有机骨架材料(covalent organic framework materials, COF)是一种新型多孔材料,由轻质元素组成,通过强共价键与有机单体连接[22,23]。因为COF具有大的负载容量、可调节的孔径、高比表面积、高热稳定性和化学稳定性[24,25]等优点,所以被广泛应用于固相萃取技术。

在本研究中,我们制备了以亚胺连接的多孔共价有机骨架材料(imine-linked porous covalent organic framework material, IL-COF-1),作为SPE的吸附剂,用来富集蜂蜜中的雌激素。采用单因素优化法对固相萃取条件进行优化,提出了一种用于蜂蜜中雌激素定量检测的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(SPE-HPLC-MS/MS)方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

SWPRATM55扫描电子显微镜(德国蔡司公司), Nicolet710傅里叶变换红外光谱仪(美国尼高力公司), Empyrean锐影X射线衍射仪(XRD, 荷兰PANAlytical B. V.公司), ASAP 2020型比表面积测定仪(美国Micromeritics公司), JEM-7500型透射电子显微镜(TEM),高速离心机(Heraeus Multifuge X1R,美国赛默飞公司),液相色谱-三重四极杆质谱仪(AB SCIEX Triple Quad TM 5500,美国AB SCIEX公司)。

1,3,6,8-四(4-甲苯基)芘(TFPPy)、对苯二胺(p-PDA)、1,2-二氯苯、1-丁醇、乙酸购于国药集团化学试剂有限公司(中国上海);雌酮(E1)、己烯雌酚(DES)、雌三醇(E3)、β-雌二醇(E2)、炔雌醇(EE2)购于TCI (日本东京);甲醇、乙腈、丙酮均为HPLC级,购于默克有限公司(德国);空柱管、筛板购于Biocomma Limited (中国深圳);实验用水为超纯水。

1.2 样品制备及溶液配制

1.2.1样品制备

蜂蜜样品购于当地零售市场,首先用20 mL超纯水稀释1 g蜂蜜于离心管内,然后涡旋2 min。使用0.45 μm微孔滤膜(水系,尼龙)过滤,备用。

1.2.2溶液配制

单标准储备溶液:称取适量雌激素标准品,用甲醇溶解,配成1 000 mg/L标准储备溶液;混合标准溶液:分别准确移取适量单标准储备溶液,以甲醇定容,配制成10 mg/L的标准混合溶液。4 ℃保存,使用时稀释成所需浓度。

1.3 材料及固相萃取装置的制备

1.3.1材料制备

IL-COF-1样品是依据文献[25]方法合成的。准确称取TFPPy (80 mg, 0.128 mmol)与p-PDA (28 mg, 0.256 mmol)固体粉末置于Pyrex管中,然后加入1,2-二氯苯(2 mL)和1-丁醇(2.0 mL)。在室温条件下超声处理1 min,向溶液中添加0.4 mL的醋酸水溶液(6 mol/L)。随后,将试管放入液氮浴中,快速冷冻、抽真空解冻,反复3次。然后将混合溶液升温至120 ℃反应72 h,自然冷却至室温,通过离心分离固体反应产物,用甲醇洗涤,在60 ℃下真空干燥12 h,得到浅黄色固体粉末,即为IL-COF-1。IL-COF-1的元素分析结果:C, 87.39%; N, 7.84%; H, 4.76%。

1.3.2固相萃取装置的制备

将30 mg IL-COF-1填入已放入垫片的SPE空柱管(体积3 mL)中,铺平,将另一片垫片轻压在材料上,组装SPE柱。将组装好的SPE柱放置在固相萃取装置上,装置的一端与真空泵连接,另一端与采样器连接,采样器的末端插入水样中,用于抽取实际稀释的蜂蜜样品。

使用前用2 mL甲醇、超纯水对SPE柱进行活化;然后上样,20 mL实际蜂蜜样品(调节溶液pH=7)以3 mL/min的速度通过SPE柱;上样后用5 mL超纯水淋洗吸附在SPE柱上的杂质;常压干燥5 min,用5 mL 1%(v/v)氨水-甲醇溶液洗脱。洗脱液氮吹至干,残渣用1 mL甲醇溶解,涡旋混匀30 s后,过0.22 μm微孔滤膜(有机系统,尼龙),用HPLC-MS/MS分析。

1.4 HPLC-MS/MS条件

色谱条件 Thermo Fisher Scientific C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm);流动相A为乙腈,B为5 mmol/L的乙酸铵;等度洗脱:0～5 min, 45%A和55%B。柱温40 ℃,自动进样器温度10 ℃。

质谱条件 电离方式:ESI-;扫描方式:多反应监测(MRM)模式;气帘气压力:275 kPa (40 psi);喷雾电压:5.5 kV;离子源温度:500 ℃;雾化气压力:345 kPa (50 psi);碰撞气、雾化气:N2。外标法定量,其他参数见表1。

表 1 雌激素的多反应监测模式参数

2 结果和讨论

2.1 IL-COF-1的表征

如图1a所示,扫描电子显微镜图像显示IL-COF-1呈均匀的珊瑚状形态,具有约30～70 nm的聚集立方体形貌,与透射电子显微镜图像显示的IL-COF-1形态一致(见图1b)。XRD图谱显示了IL-COF-1的晶体结构,观察到5个衍射峰分别在(110)、(020)、(220)、(130)和(330)处,与文献[25]数据一致(见图1c)。IL-COF-1的BET比表面积为2 023 m2/g(见图1d)。孔径约为3 nm (见图1e)。傅里叶红外光谱(FT-IR)如图1f所示,1 621 cm-1处的峰显示特征C=N键。光谱中还观察到C=O (1 623 cm-1)和N-H (1 603 cm-1)振动,这验证了IL-COF-1表面存在醛和胺官能团化的单体,有利于雌激素和IL-COF-1之间发生分子间O-H…N=C氢键相互作用。

图 1 IL-COF-1材料的表征Fig. 1 Characterization of imine-linked porous covalent organic framework material (IL-COF-1) a. SEM image; b. TEM image; c. X-ray diffraction (XRD) patterns; d. nitrogen adsorption/desorption isotherms; e. pore size distribution curves; f. FT-IR spectrum.

2.2 固相萃取条件的优化

对IL-COF-1吸附剂的吸附能力进行验证。以E1、E2、E3、EE2和EDS 5种雌激素作为目标物,E3、E2和EE2的含量为10 ng/g, E1和DES的含量为1.0 ng/g,利用这些化合物的回收率评价IL-COF-1对雌激素的萃取效果。为了获取最优的固相萃取条件,优化了IL-COF-1的用量、样品溶液pH、样品流速、洗脱液体积、洗脱液流速、样品溶液中NaCl的含量及洗脱液类型。

考察了20～40 mg IL-COF-1用量对样品回收率的影响(见图2a)。结果表明,使用30 mg吸附剂的回收率最高。因此,实验中使用30 mg IL-COF-1作为固相萃取填料。IL-COF-1的用量与其高比表面积密切相关。

图 2 (a) IL-COF-1的量、(b)样品pH、(c)样品流速、(d)洗脱液体积、(e)洗脱液流速和(f) NaCl浓度对雌激素萃取效率的影响(n=6)Fig. 2 Effects of (a) IL-COF-1 amount, (b) sample pH, (c) sample flow rate, (d) eluent volume, (e) flow rate of eluent, and (f) NaCl concentration on estrogen extraction efficiency (n=6)

样品pH值是影响雌激素回收率的重要因素之一,与样品溶液中目标物的存在状态有关。选取样品pH值范围为3～8,如图2b所示,在pH=7时,5种雌激素的回收率最高。可能是因为雌激素和IL-COF-1之间的相互作用主要有π-π相互作用和疏水相互作用。IL-COF-1与目标物之间的作用力与目标物的状态有关,不同的状态可能产生不同的作用力。在pH=7时,化合物以分子状态为主,IL-COF-1与目标物之间的作用力最强。因此,选择pH=7。

样品流速是影响目标物质滞留时间和预处理时间的主要因素,考察了样品流速在1～5 mL/min 范围内的萃取效果。在1～3 mL/min范围内,随着样品流速增大,回收率增大,一直保持在80%以上(见图2c)。3～5 mL/min范围内,回收率随样品流速增加而下降。因此,采用3 mL/min作为适宜的样品流速。

考察了洗脱液(1%(v/v)氨水-甲醇溶液)体积在2～8 mL范围内的萃取效果(见图2d)。在2～5 mL范围内,随着洗脱液体积的增加,雌激素回收率逐渐升高。而洗脱液超过5 mL后回收率几乎保持不变(见图2d)。所以,实验中洗脱液体积选择5 mL。

洗脱液流速显著影响雌激素和IL-COF-1之间的接触反应时间。考察了洗脱液(1%(v/v)氨水-甲醇溶液)流速在0.2～1.0 mL/min范围内的萃取效果。在0.2、0.4 mL/min时,回收率维持在85%以上(见图2e)。0.4～1.0 mL/min范围内,回收率随洗脱液流速增加而下降。因此,选择0.4 mL/min作为最佳洗脱液流速。

考察了NaCl对目标物质萃取效率的影响。将NaCl添加到20 mL的样品溶液中,配制含不同浓度NaCl样品溶液进行萃取实验。如图2f所示,当NaCl浓度在0～0.2 mmol/L范围时,回收率出现缓慢下降的趋势。0.2～0.5 mmol/L范围时回收率下降速度增加。所以,在萃取过程中不添加NaCl。

在SPE过程中,洗脱液种类是影响萃取效率的关键因素。考察了不同类型的洗脱液,包括甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%(v/v)氨水-甲醇溶液、1%(v/v)氨水-乙腈溶液和1%(v/v)氨水-乙酸乙酯溶液对萃取效果的影响(见图3)。当使用1%(v/v)氨水-甲醇溶液作为洗脱液时,5种目标物质的回收率最高。因此,选择1%(v/v)氨水-甲醇溶液作为本实验的洗脱液。

图 3 洗脱液种类对雌激素萃取效率的影响(n=6)Fig. 3 Effect of eluent type on estrogen extraction efficiency (n=6) 1. methanol; 2. acetonitrile; 3. ethyl acetate; 4. 1% (v/v) NH3·H2O-methanol; 5. 1% (v/v) NH3·H2O-acetonitrile; 6. 1% (v/v) NH3·H2O-ethyl acetate.

综上,5种雌激素的最佳萃取条件为:IL-COF-1用量为30 mg, 1%(v/v)氨水-甲醇溶液作为洗脱液,洗脱液体积为5 mL,洗脱液流速为0.4 mL/min,样品流速为3 mL/min,样品pH=7,萃取过程中不添加NaCl。

2.3 IL-COF-1的稳定性和重复性

以E1、E2、E3、EE2和EDS 5种雌激素作为目标物,E3、E2和EE2的含量为10 ng/g, E1和DES的含量为1.0 ng/g。利用回收率评价IL-COF-1的重复性和稳定性,采用最佳萃取条件进行实验。

IL-COF-1的制备重复性 以6个批次制备的IL-COF-1作为固相萃取柱的填料,不同批次间目标物回收率的相对标准偏差(RSD)为5.2%～9.1%,表明IL-COF-1具有较好的制备重复性。

IL-COF-1的可重复使用性 对同一根固相萃取柱连续使用6次后,目标物回收率的RSD为2.5%～6.1%,表明IL-COF-1具有较好的可重复使用性。

IL-COF-1的稳定性 使用同一根IL-COF-1固相萃取柱在6天内(每天试验一次)获得的雌激素回收率为95.1%～107.4%, RSD值为6.2%～8.9%,表明其稳定性较好。

2.4 方法验证

分别吸取不同体积的单标储备溶液,加入到20 mL(含1 g蜂蜜)的水溶液中,得到含E3、E2和EE21、10、25、50、100、250和500 ng/g以及E1和DES 0.1、0.5、1、10、25、50、100 ng/g的混合标准溶液,检测,绘制标准曲线。在最优条件下,如表2所示,该方法对E3、E2和EE2的线性范围为1～500 ng/g,对E1和DES的线性范围分别为0.1～100 ng/g,相关系数(r)为0.993 4～0.997 2。检出限(LOD,S/N=3)为0.01～0.30 ng/g,定量限(LOQ,S/N=10)为0.05～0.95 ng/g。

对含量为50 ng/g的5种雌激素进行重复性实验,日内精密度RSD为3.2%～6.6%,日间精密度RSD为4.2%～7.9%。

这些结果表明,基于IL-COF-1的SPE方法具有较高的灵敏度、良好的线性关系和较好的重复性。IL-COF-1材料作为SPE的吸附剂,可以用于蜂蜜样品中5种雌激素的检测。

2.5 方法应用

使用所开发的SPE-HPLC-MS/MS方法测定蜂蜜样品中的雌激素,2种蜂蜜样品中均未检测到5种雌激素。为了验证本方法的准确性,进行了加标回收试验,结果见表3和图4。3个加标水平(5、25、50 ng/g)下的回收率为80.14%～115.24%。以上结果表明,IL-COF-1作为吸附剂能很好地用于蜂蜜中雌激素的萃取。

在固相萃取过程中,IL-COF-1和雌激素之间可能存在如下相互作用:(i) IL-COF-1和雌激素中的芳香单元有利于形成π-π相互作用[26]; (ii)考虑到N和O等电负性原子的存在,雌激素和IL-COF-1之间也可能发生分子间O-H…N=C氢键相互作用[27]; (iii) IL-COF-1的高比表面积通过上述相互作用可增强雌激素与IL-COF-1的接触;(iv)孔径效应会阻止样品中大分子的通过,促进萃取过程中目标分析物的吸附和解吸。

表 2 SPE-HPLC-MS/MS方法分析性能

表 3 蜂蜜样品中5种雌激素的加标回收率(n=5)

图 4 (a)空白蜂蜜样品、加标(b)5 ng/g和(c)25 ng/g雌激素的蜂蜜样品的色谱图Fig. 4 Chromatograms of (a) a blank honey sample and blank honey sample spiked with (b) 5 ng/g and (c) 25 ng/g estrogens

3 结论

以IL-COF-1作为吸附剂,基于SPE技术和HPLC-MS/MS,建立了一种高效、灵敏的分析蜂蜜样品中痕量雌激素的新方法。方法学验证结果表明本方法具有较低的检出限和较宽的线性范围,稳定性和重复性良好。将本方法应用于实际蜂蜜样品分析,取得了满意的结果。IL-COF-1在雌激素的固相萃取中表现出优越的性能,需要进一步探索IL-COF-1在痕量分析中的应用。