实时荧光定量PCR 对社区暴露腹泻样本CA-CDI 的诊断价值

郑瑞兵，张卉卉，应建飞，汪一萍

艰难梭菌（CD）属于厌氧芽孢杆菌，能以芽孢形式长期存活于土壤或水环境中，经粪-口途径传播，是抗生素相关性腹泻和医疗机构相关性腹泻重要病原体之一[1]。艰难梭菌感染（CDI）患者常表现为腹泻、伴或不伴腹痛及发热等症状，轻中度症状具有自限性，重度及暴发型感染患者则易引发全身症状，威胁患者生命健康[2]。我国CDI 发病呈现逐年上升趋势，作为我国丙类法定传染病的重要病原体之一，CD的诊断与检测技术评估，对疾病的二级预防具有重大意义[3-4]。社区获得性艰难梭菌感染（CA-CDI）是指在医院外罹患的CDI[5]。相关研究显示，社区获得性腹泻中CDI 率为14%，培养阳性率为5%～6%[6]。CD 的毒性主要来源于两大毒素，毒素A（tcd-A）为外毒素，结合肠黏膜刷状缘以破坏其正常生理结构；毒素B（tcd-B）发挥细胞毒作用，破坏肠上皮细胞的细胞骨架结构从而形成伪膜[7]。本研究选取社区来源非重复腹泻粪便标本，运用实时荧光定量PCR 法对tcd-B 基因进行扩增检测，评估实时荧光定量PCR 法直接检测粪便标本与“金标准”[产毒培养法（TC）+细胞毒性酶免疫分析（EIA）][8]诊断结果的差异，为进一步的CA-CDI 社区干预提供更多依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 样本 选取2016年4-10月宁波市社区医疗机构就诊的具有社区暴露史的腹泻患者，符合：（1）腹泻发病前6 周无住院经历；（2）非重复有效腹泻标本；（3）具有CDI 临床诊断特征（危险因素+临床表现）[9]；（4）社区暴露腹泻样本行CA-CDI检测，以TC+EIA为“金标准”[10]。排除：（1）具有医院暴露史；（2）重复腹泻标本。最终获得有效腹泻标本329例，并及时进行厌氧培养。其中男191例，女138例；年龄3 ～81岁，平均（42.1±25.6）岁。

1.2 方法

1.2.1 样本采集与运输 嘱被检测者于干燥清洁便盆内自然排便，以无菌采便管/盒挑取粪便中存在黏液、脓液或血液的部分4 ～6 g（液体粪便≥5 ml），4℃保存，24 h 内完成免疫学检测。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 实时荧光定量PCR 法（1）仪器与试剂：仪器选取实时荧光定量PCR仪（Cepheid，美国），试剂采用艰难梭菌荧光PCR 检测试剂盒[（tcd-B）XY-DT-D-1330，xuanya]。（2）方法：拭子蘸取少量待测样本插入含样品处理液的小瓶后震荡混匀，加样后按照试剂盒说明书操作，将反应体系放入荧光PCR 仪进行扩增，并于退火/延长过程中记录荧光信号。采用通用循环法，即以95℃10min 进行酶活化；95℃15s 进行变性，循环35 ～40 轮；60℃60s进行退火/延伸。（3）反应结束后，根据荧光信号与Ct 值判断扩增结果。

1.2.2.2 TC+EIA 鉴定（1）CD 培养：取约0.2 ml 粪便标本与Eugon 肉汤（美国BBL公司）1∶1 混匀，并于80 ℃加热10 min；接种环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂平板（CCFA）和增菌肉汤，行35 ℃厌氧菌培养。如直接培养阴性可取变成红色的肉汤转移CCFA 继续培养并鉴定；CD在CCFA上呈白色或淡黄色不透明的扁平状“摊鸡蛋样”菌落，分离CD 菌株入－40 ℃低温冰箱保存。（2）EIA 鉴定：采用毒素A+B 抗原ELISA 试剂盒（C.difficile toxins A+B ELISA，ELA4448 DRG，96T），检测tcd-A、tcd-B。

1.3 统计方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，计数资料以n（%）表示，待评估检测手段与“金标准”诊断结果差异性检验采用McNemar 检验，一致性检验采用Kappa 分析。

2 结果

2.1 329例社区暴露腹泻标本CA-CDI检测情况 艰难梭菌荧光PCR 检测共检测tcd-B阳性14例，阳性率为4.26%；其中包括1例荧光PCR 检测CA-CDI（+）但培养（－）标本。排除1例培养（+）但EIA 鉴定阴性标本，TC 法共获得产毒CD 17 株（5.17%），阳性菌株ELISA法定性测定毒素基因tcd-A 和tcd-B，15株标本为tcd-A（+）、tcd-B（+）样本；1 株为tcd-A（－）、tcd-B（+），1 株为tcd-A（+）、tcd-B（－）。

2.2 两种检测法对CA-CDI 检测效能比较 艰难梭菌荧光PCR 检测试剂盒（tcd-B）对CA-CDI 检测结果与“TC+EIA 鉴定”结果差异无统计学意义（P=0.375，双侧检验），一致性检验Kappa 值为0.831。艰难梭菌荧光PCR 检测试剂盒（tcd-B）对CA-CDI 检测灵敏度为76.47%，特异度为99.68%，见表1～2。

表1 实时荧光定量PCR与产毒培养对CACDI 检测结果比较 例

2.3 两种检测法对tcd-B检测效能比较艰难梭菌荧光PCR 检测试剂盒（tcd-B）对tcd-B 检测结果与“TC+EIA 鉴定”结果差异无统计学意义（P=0.625，双侧检验），一致性检验Kappa 值为0.860。艰难梭菌荧光PCR 检测试剂盒（tcd-B）对tcd-B 检测灵敏度为81.25%，特异度为99.68%，见表2～3。

表2 实时荧光定量PCR 对不同诊断目标的检测效能参数 %

表3 实时荧光定量PCR 与产毒培养对产毒基因tcd-B 检测结果比较例

3 讨论

CDI 是肠道菌群失调，进而产毒性CD大量繁殖并产生毒素导致的[11]。以往研究多着眼于医院CDI 的检测与治疗，关于的CA-CDI 研究相对较少[12-13]。本研究就是着眼于CA-CDI，分析在社区暴露腹泻患者群体中，病原分子生物学检测手段的检测效能。

现有的CDI 检测技术包括粪便厌氧培养、EIA、谷氨酸脱氢酶（GDH）检测及荧光定量PCR 检测等[14]。本研究选取实时荧光定量PCR 为主要待评估检测手段，以TC+EIA 为“金标准”进行比较，结果显示，艰难梭菌荧光PCR 检测试剂盒（tcd-B）检测CA-CDI 阳性率为4.26%；“金标准”检测CA-CDI 阳性率为5.17%（17/329），与以往研究中1%～7%的人群携带率相符[15]。出现1例实时荧光定量PCR 检测样本tcd-B（+）但培养（－）标本，考虑为运输及保存过程中空气暴露时间过长引起的假阴性结果。另有1例TC 法对样本CA-CDI 检测中培养（+），但进一步EIA 检测显示均为阴性，考虑源于TC 无法区分产毒与非产毒CD 的检测缺陷导致[16]。艰难梭菌荧光PCR 检测试剂盒（tcd-B）对社区暴露腹泻样本CA-CDI诊断灵敏度与特异度分别为76.47%和99.68%；对tcd-B 检测灵敏度与特异度分别为 81.25%和99.68%；与“金标准”检测一致性分别达到0.831 和0.860。这说明社区暴露腹泻样本CA-CDI 产毒基因tcd-B 的实时荧光定量PCR 检测效能较高，可代替TC 进行快速的独立检测。

总之，实时荧光定量PCR 技术检测粪便样本，具有简单快捷且准确率高等优点，对CA-CDI诊断效能良好，方便在基层医疗单位广泛应用。