微生物亚硝化抑制剂对风干肠风味物质形成的影响

陈援援 马凯华 张雨婷 郑翔飞 张新渝 马俪珍

(天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384)

风干肠是一种天然发酵香肠，以其独特的风味、色泽和质地而闻名于中国东北地区。传统的风干肠主要依靠内源酶和存在于原料中的“野生”微生物起作用，这些“野生”微生物主要包括革兰氏阴性菌、氧化酶阳性菌、需氧菌和少量革兰氏阳性菌[1]。当生长环境适宜时，这些革兰氏阳性菌，如乳酸菌和葡萄球菌，可能成为优势菌群[1-2]。因此，对天然菌群的依赖会导致风干肠品质不一[3]。为了使生产过程标准化，一些发酵剂被用于缩短发酵时间，提高产品质量，并保持最终发酵产品的独特风味[4]。近年来，有关接种微生物发酵以改善产品风味，确保食品安全的研究较多[5]，但对其发酵机理和风味化合物形成的研究还需深入。Lu等[6]研究了不同发酵温度下酸肉菌群与代谢产物的关系，己醛、苯甲醛、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和辛醛被确定为酸肉中乳酸杆菌产生的挥发性有机化合物，为风味的主要来源。Hongthong等[7]研究了接种植物乳杆菌对Isan香肠品质的影响，发现接种107CFU/g植物乳杆菌后的样品在感官评价上具有更高的硬度和更强烈的风味，并提高了香肠的亮度值。Bao等[8]研究发现，接种混合发酵剂乳酸乳球菌和窦氏魏斯氏乳酸菌能改善臭鳜鱼的品质、促进风味的形成和缩短发酵时间。发酵肉制品中产生风味的主要途径有蛋白质降解、脂质氧化、美拉德反应和微生物4种[9]。蛋白质降解过程中产生的氨基酸代谢产物占总挥发性化合物的6%[10]，在风味形成中起着重要作用。氨基酸可以通过微生物转氨酶转化为酮酸，作为重要的中间体，α-酮酸可以直接或间接代谢成相应的醛类化合物。此外，醛可以被醇脱氢酶和醛脱氢酶转化为相应的醇和羧酸[11]。Chen等[12]研究发现，接种混合发酵剂组风干肠氨基酸代谢产生的化合物水平高于对照组(P<0.05)，可以促进乙基酯的形成，改善发酵风味。因此，乳酸菌发酵有助于形成复杂的风味成分，如氨基酸、维生素和有机酸，这些成分改善了产品的风味、滋味和其他特性[13]。

实验室[14]前期筛选得到的PRO-MIX5(木糖葡萄球菌、清酒乳杆菌、类植物乳杆菌)能够有效抑制红肠和风干肠中N-亚硝胺(NAs)的形成，其抑制机理主要是其菌体碎片即微生物亚硝化抑制剂(MNI)的作用，且0.05%的MNI对红肠和培根中的NAs有较好的抑制效果，并能提高产品的感官品质。目前，关于MNI在风干肠中的应用尤其是MNI与混合发酵剂协同作用对风干肠风味方面的研究尚未见报道。研究拟对风干肠的工艺参数进行调整，提高发酵温度为30 ℃，降低风干成熟过程的温度(14～16 ℃)；将前期优选出的能提高风干肠安全品质的PRO-MIX发酵剂、发酵牛骨调味基料和复配抗氧化剂(FBFA)以及MNI应用于风干肠加工中，探讨3种抑制剂尤其是MNI对风干肠成品风味物质形成的影响，旨在为MNI在风干肠中的开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷却排酸成熟24 h的猪后腿肉、猪肥膘：天津二商迎宾肉类食品有限公司；

食盐、白沙糖、曲酒、味精、酱油：市售；

茶多酚、迷迭香：豫中生物科技有限公司；

维生素E、异抗坏血酸钠：苏州佰亿鑫生物科技有限公司；

PRO-MIX5复合商业发酵剂(木糖葡萄球菌、清酒乳杆菌、类植物乳杆菌)：活菌数1011CFU/g，封装于无菌玻璃瓶中冻藏(-20 ℃)，意大利萨科公司；

人工胶原蛋白肠衣：牛二层皮提取、孔径30 mm，神冠控股(集团)有限公司；

2-甲基3-庚酮：分析纯，美国Supelco公司；

气相色谱—质普联用仪：GCMS-QP2010Plus型，日本岛津公司；

超快速气相电子鼻：HeraclesII型，法国Alpha M.O.S公司；

电子舌：TS-5000Z型，日本INSENT公司；

氨基酸分析仪：S-43000型，德国Sykam公司；

恒温恒湿箱：CLIMACELL型，艾力特国际贸易有限公司；

真空搅拌机：BVBJ-30F型，浙江嘉兴艾博实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 FBFA制备 参照樊晓盼等[15]的方法制备FBF，复合抗氧化剂(CA)添加量：茶多酚、迷迭香、VE和抗坏血酸钠添加量60.14,60.11,60.00,60.00 mg/kg[16]。

1.2.2 MNI制备 参照李秀明等[17]的方法。

1.2.3 风干肠制作流程

原料肉→预处理→腌制→拌馅→罐肠→风干成熟→成品

操作要点：

(1) 腌制：将猪后腿肉剔除筋膜、脂肪，切成8 cm×5 cm×3 cm的方块，用绞肉机搅碎(筛板孔径8 mm)，放入真空搅拌机中，加入占肉总质量(风干肠肥瘦质量比1∶9)1.8%的食盐、0.01%的亚硝酸钠(预先用少量水溶解)和抗坏血酸钠0.55 g/kg，真空搅拌5 min，取出后放入不锈钢盆中，紧贴肉表面盖一层保鲜膜，4 ℃腌制24 h。

(2) 拌馅：将腌制好的肉倒入真空搅拌机中，依次加入4%糖、1.5%曲酒、0.2%味精、0.3%生抽、10%水、真空搅拌8 min。

(3) 灌肠：将制好的肉馅灌入胶原蛋白肠衣中，结扎(每节13～15 cm)、排气。

(4) 发酵：将罐制好的肉馅于30 ℃，RH 90%，风速100%的恒温恒湿培养箱中进行发酵，使其pH降至接近5.4后，终止发酵。

(5) 成熟：按表1调节恒温恒湿培养箱的温度、RH和风速。

表1 风干肠工艺参数Table 1 Process parameters of air-dried sausage

1.2.4 试验设计方案

(1) CK组：按风干肠的基础配方和工艺制作。

(2) MNI组：按风干肠的基础配方和工艺制作，按肉重的0.05%加入由PRO-MIX5制备的菌体碎片(微生物亚硝化抑制剂，MNI)。

(3) MNIP组：按风干肠的基础配方和工艺制作，按肉重的0.05%加入MNI，接入20 g/100 kg的PRO-MIX5商业复合菌(木糖葡萄球菌、清酒乳杆菌、类植物乳杆菌)。

(4) FBFAP组：按风干肠的基础配方和工艺制作，按肉重的2%加入FBF和CA，接入20 g/100 kg的PRO-MIX5商业复合菌(糖葡萄球菌、清酒乳杆菌、类植物乳杆菌)。

1.2.5 指标测定

(1) 游离氨基酸含量：参照牛树彬等[18]的方法，按式(1)计算单个游离氨基酸的滋味强度值(TAV)。

(1)

式中：

TAV——滋味强度值；

C1——呈味化合物含量，mg/100 g；

C2——呈味化合物的滋味阈值，mg/100 g。

(2) HeraclesII 超快速电子鼻分析：参照陈援援等[19]的方法。

(3) 电子舌分析：参照陈援援等[19]的方法。

(4) 挥发性风味物质(GC-MS)检测：参照雷虹[20]的方法。

(5) 气味活度值(OAV) 计算：参照张凯华等[21]的方法。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件计算平均值和标准差，用SPSS 19.0软件进行显著性分析，Origin 2018软件作图。显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 风干肠成品挥发性风味物质PCA分析

由图1可知，主成分1和主成分2的方差贡献率分别为94.127%，4.495%，累计方差贡献率为98.622%，表明这两个主成分足以代表样品的大部分信息。4组风干肠成品之间不存在交叉和重合，说明CK、MNI、MNIP和FBFAP组风干肠中挥发性成分的种类和含量存在差异。其中MNI组和MNIP组之间的相对距离较近，说明两组样品之间存在相同的挥发性风味物质，可能是两者的特征挥发性风味物质比较突出所以将两者区分开来。

图1 基于气相电子鼻检测风干肠成品挥发性 风味物质的PCA分析Figure 1 PCA analysis of volatile flavor substances in air-dried sausage products based on gas phase electronic nose detection

2.2 风干肠的有效味觉

由图2可知，主成分1和主成分2的方差贡献率分别为98.873%，0.921%，累积方差贡献率为99.794%。4组风干肠成品在味觉上存在一定差异，但MNI组和MNIP组在8个味觉指标上比较接近，FBFAP组和CK组的比较接近。酸味的无味点为-13，苦味回味、涩味回味和丰富性的无味点为0，4组风干肠成品的酸味、苦味回味、涩味回味和丰富性在传感器上的响应值低于无味点，说明4组样品在这4个味觉指标的滋味特征不明显；咸味的无位点为-6，苦味、涩味和鲜味的无味点为0，4组样品的苦味、涩味、鲜味和咸味在传感器上的响应值大于无味点，说明这4个味觉指标是4组风干肠成品有效且重要的味觉指标。MNI组和MNIP组的鲜味响应值最高，苦味和咸味响应值低于CK组，说明加入MNI、MNIP能降低苦味和咸味，提高风干肠的鲜味。

图2 基于电子舌检测风干肠成品的PCA和有效味觉指标分析Figure 2 PCA and effective taste index analysis of air-dried sausage based on electronic tongue

2.3 风干肠成品的游离氨基酸组成

由表2可知，谷氨酸、丙氨酸、牛磺酸和肌肽是4组风干肠中的主要游离氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸呈鲜味，在MNI组和MNIP组中的含量显著高于CK组和FBFAP组，说明加入MNI和MNIP有利于风干肠鲜味氨基酸的形成。牛磺酸是一种具有显著抗氧化活性的化合物[22]，在3个处理组中的含量明显高于CK组(P<0.05)。甜味氨基酸总量在FBFAP组中最高，苦味氨基酸总量在CK组中最高，说明加入FBFAP能改善终产品的甜味、抑制苦味。研究[23]表明，蛋白质过度水解会给肉制品带来苦味或金属味。4组风干肠游离氨基酸总量大小为MNIP组>CK组>FBFAP组>MNI组，FBFAP组中的游离氨基酸总量低于CK组(P<0.05)，与Hu等[24]的结果不一致，可能是由于产品配方、加工条件和微生物种群不同。4组风干肠游离氨基酸总量不同，是因为肌肉和细菌来源的酶活性受加工参数的影响，如温度、相对湿度、发酵时间和pH值变化等。在前期试验的基础上改变工艺条件，新增了一个较高温度30 ℃的发酵阶段，MNI组和MNIP组的产酸速度快，分别在发酵第15.0，12.5 h结束发酵，CK组和FBFAP组分别在发酵第22，21 h结束发酵，由于发酵时间、肉馅pH值和添加物不同，4组风干肠的游离氨基酸含量有差异，此外，也有可能是游离氨基酸参与风味物质的形成而减少。综上，加入MNIP能缩短风干肠的发酵时间，促进风干肠鲜味氨基酸的生成和提高游离氨基酸总量。

表2 风干肠成品的游离氨基酸组成†Table 2 Free amino acid composition of 4 groups of air-dried sausages

2.4 风干肠成品游离氨基酸的味觉特征及TAV值

由表3可知，4组风干肠中TAV值>1的氨基酸有4种，包括谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和组氨酸。谷氨酸的TAV值最高，对风干肠滋味贡献度最大。其次是丙氨酸、缬氨酸和组氨酸，丙氨酸为甜味氨基酸，缬氨酸和组氨酸为苦味氨基酸，TAV较小，对风干肠滋味贡献度较小，所以风干肠主要呈鲜甜味。MNIP组中谷氨酸的TAV值最高，其次是MNI组，由于MNIP组中对鲜味有贡献的游离氨基酸含量均高于其他3组，因此MNIP组发酵的风干肠鲜味更强烈，同时说明在接种有发酵剂PRO-MIX5时，添加MNI促进风干肠中鲜味强度增加的效果优于FBFA。

表3 风干肠成品游离氨基酸的味觉特征及TAV值Table 3 Taste characteristics and TAV values of free amino acids in 4 groups of air-dried sausages

2.5 基于GC-MS分析风干肠成品挥发性风味物质

由表4可知，酯类、醇类、酸类、醛类和杂环化合物类是4组风干肠主要的风味成分。MNI、MNIP和FBFAP组中检出的风味物质总量显著高于CK组(P<0.05)，主要归因于发酵过程中发生的生化反应，如碳水化合物发酵、氨基酸代谢、蛋白质氧化、脂质自氧化、脂质β-氧化和酯化等[25-26]强度不一致。

表4 4组风干肠成品挥发性风味物质相对含量†Table 4 Relative mass concentration of volatile flavor substances in 4 groups of air-dried sausage products μg/kg

续表4

续表4

2.5.1 醛类物质 一般来说，脂质自动氧化会产生醛类物质，由于其低阈值，对风干肠整体风味贡献较大[9]。4组风干肠中醛类物质总量大小为MNI组>MNIP组>FBFAP组>CK组，说明加入MNI、MNIP能促进风干肠中醛类风味物质的形成与积累。4组样品中均检测到苯甲醛和苯乙醛，主要是由细菌代谢芳香族氨基酸产生[1]。醛类物质中，正己醛含量最高且在4组样品中差异显著(P<0.05)，可能是由于乳酸菌中相关酶的活力不同。反式-2-辛烯醛、正己醛、反式-2,4-壬二烯醛、反式-2,4-庚二烯醛、反-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、2-十一烯醛、反式-2-庚烯醛和正辛醛是MNI组和MNIP组的特征醛类物质。线性醛类主要来自不饱和脂肪酸的氧化降解，如油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸[23]，而支链醛的主要形成途径为氧化脱氨脱羧，可能通过Strecker降解产生。

2.5.2 醇类、酮类物质 醇的产生有多种方式，如氨基酸代谢、脂质氧化和甲基酮还原[27]。乙醇是4组风干肠中含量最丰富的化合物，在MNI组和MNIP组中含量最高，可能与乳酸菌主导的碳水化合物发酵、氨基酸代谢和风干肠制作过程中加入的曲酒有关，Lin等[28]研究发现，在乳酸菌的氨基酸代谢过程中，其中一条氨基酸途径与两种脱氢酶有关，即α-酮酸脱氢酶和羟基酸脱氢酶，具有抗氧化能力的乳酸菌菌株可以增强氨基酸的降解，并通过还原反应促进醛生成更多的醇。还可能是加入的MNI具有一定的抗氧化性，MNI是PRO-MIX5发酵剂的细胞破碎物，该细胞破碎物含有多种生物活性成分，如胞外多糖。研究[29]发现，乳酸菌是优良的胞外多糖产生菌。植物乳杆菌c88胞外多糖具有显著清除活性氧效果，其他植物乳杆菌的胞外多糖在高浓度下对DPPH自由基和超氧自由基有较强的清除能力[30-31]。Nehal等[32]研究发现，乳酸菌产生的胞外多糖具有抗氧化作用，且抗氧化效率与胞外多糖浓度有关。1-辛烯-3-醇具有蘑菇味和花香，是发酵肉制品中常见的不饱和醇[33]，4组风干肠中均有检出，其在MNI组和MNIP组中的相对质量浓度最高。正庚醇、正丁醇可通过风干肠中的乳酸菌和酵母介导的某些氨基酸转化而得[34]。4组风干肠中检测到含量较高的3-羟基-2-丁酮，尤其是在MNIP组中最高，丙酮酸可通过一系列代谢反应转化为2,3-丁二酮，而2,3-丁二酮将通过各种还原酶转化为3-羟基-2-丁酮[35]，Chen等[12]研究发现接种清酒乳杆菌会增加发酵香肠中3-羟基-2-丁酮含量。

2.5.3 酸类物质 风干肠发酵成熟过程中产生的有机酸可增强对香气的感知[36]。4组风干肠中共鉴定出16种酸类物质，其中含量较高有醋酸、正己酸、辛酸、丁酸、4-甲基戊酸、异戊酸、正癸酸、3-已烯酸和异丁酸，醋酸可以由乳酸菌、葡萄球菌的脂肪酸氧化和丙氨酸分解代谢形成，丁酸可能来自于脂质氧化或缬氨酸脱氨[37]。CK组中酸类物质总量显著高于其他3个处理组(P<0.05)，FBFAP组次之，MNI组和MNIP组中酸类物质总量差异不显著。Lin等[15]研究表明，乳酸菌代谢产生的醇和有机酸在酯酶和烷基转移酶的作用下生成相应的酯，进而使MNI、MNIP和FBFAP组中酸类物质含量降低。

2.5.4 酯类物质 酯类是4组风干肠中含量最丰富的挥发性风味物质，共检出40种酯类。FBFAP组中酯类物质总量最高，其生成取决于醇和酸的存在情况，以及葡萄球菌的酯化酶活性，特别是通过乙酰辅酶A或酰基辅酶A与酒精的酯化反应生成的酯，使发酵肉制品具有水果味、甜味和花香的风味[38]。辛酸乙酯、己酸甲酯、正己酸乙酯、辛酸甲酯、丁酸乙酯和乳酸甲酯是4组风干肠中最主要的酯类物质，短链酸形成的酯有水果味，这有助于形成风干肠的特殊风味。具有清酒曲香味和菠萝香味的正己酸乙酯、己酸甲酯和乳酸甲酯在MNI组和MNIP组中的相对含量最高，丁酸甲酯在CK组和FBFAP组中的含量较高，在MNI组和MNIP组中未检出，说明加入的MNI、MNIP和FBFAP能改变风干肠中酯类物质的含量。

2.5.5 杂环化合物类 肉在发酵过程中会形成杂环类化合物包括吡嗪、呋喃(杏仁味和甜味)、噻唑和吲哚类。美拉德反应产生的2-甲基吡嗪类物质，即使在较低的浓度水平，也有利于风干肠风味的形成。4组风干肠中检测出9种杂环类化合物，FBFAP组中的杂环类化合物相对含量最高，CK组次之，MNI组和MNIP组较低。研究[23]表明，接种菌株或风干肠中的原始微生物对美拉德反应底物(还原糖和氨基酸)的分解代谢可能导致这些化合物的形成或降解，但是关于其形成或降解机制需进一步深入研究。

2.6 风干肠成品挥发性风味物质OAV值

由表5可知，4组风干肠中有13种挥发性化合物的OAV>1，分别为1-辛烯-3-醇、芳樟醇、反式-2-辛烯醛、正己醛、癸醛、反式-2,4-壬二烯醛、正辛醛、辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯和异戊酸乙酯，是风干肠发酵气味的主要来源。MNI组和MNIP组的醇类(1-辛烯-3-醇)OAV值、醛类如反式-2-辛烯醛、正己醛、癸醛、反式-2,4-壬二烯醛和正辛醛的OAV值远高于CK组，说明加入MNI和MNIP有利于风干肠中醇类物质和醛类物质的呈味。正己酸乙酯和异戊酸乙酯在MNIP组中的OAV值最大，对该组风味贡献最大，芳樟醇仅在MNI组中检出，且OAV>1，说明芳樟醇是MNI组的特征风味物质。癸醛和异戊酸乙酯在FBFAP组中的OAV>1，且远大于其余3组，说明癸醛和异戊酸乙酯是FBFAP组的特征风味物质。短链脂肪酸在4组风干肠中相对含量均较高，但由于其嗅觉阈值高，对4组风干肠的风味贡献不大。

表5 4组风干肠成品挥发性风味物质OAV值Table 5 OAV value of volatile flavor substances in 4 groups of air-dried sausage products

3 结论

利用电子鼻和电子舌分别对4组风干肠的挥发性化合物和滋味进行了分析。结果表明，4组风干肠的风味和滋味均不同，且能将其明显区分开，相比较而言，微生物亚硝化抑制剂组和微生物亚硝化抑制剂与PRO-MIX5商业发酵剂协同组风味和滋味特征相似，发酵牛骨调味基料和复配抗氧化剂与PRO-MIX5商业发酵剂协同组与空白对照组的气味和滋味特征相似。鲜味、咸味、苦味和涩味是4组风干肠中有效且重要的味觉指标，加入微生物亚硝化抑制剂和微生物亚硝化抑制剂与PRO-MIX5商业发酵剂协同能提高风干肠的鲜味，降低咸味和苦味。谷氨酸、丙氨酸、牛磺酸和肌肽是4组风干肠中的主要游离氨基酸，加入微生物亚硝化抑制剂与PRO-MIX5商业发酵剂协同能缩短风干肠的发酵时间，促进风干肠鲜味氨基酸的生成和提高游离氨基酸总量；谷氨酸和丙氨酸这两种呈鲜味和甜味的氨基酸对风干肠的滋味贡献最大，4组风干肠主要呈鲜甜味。4组风干肠中共鉴定出105种挥发性风味物质，其中正己酸乙酯和异戊酸乙酯是微生物亚硝化抑制剂与PRO-MIX5商业发酵剂协同组的特征风味物质，芳樟醇是微生物亚硝化抑制剂组的特征风味物质，癸醛和异戊酸乙酯是发酵牛骨调味基料和复配抗氧化剂与PRO-MIX5商业发酵剂协同组的特征风味物质。单独添加微生物亚硝化抑制剂或微生物亚硝化抑制剂与PRO-MIX5商业发酵剂协同均能促进风干肠风味的形成。乳酸菌和微生物亚硝化抑制剂能促进风干肠中风味物质的形成，关于其产生醛类、酸类、醇类和酯类等风味物质的代谢途径和影响机制仍有待进一步研究。