谷糠多酚对酒精性胃黏膜损伤的保护作用

剌晓琴，刘一志，张立超，李汉卿,*，李卓玉

（1.山西大学生物医学研究院，山西 太原 030006；2.山西大学生命科学学院，山西 太原 030006；3.山西大学生物技术研究所，山西 太原 030006）

随着生活水平的不断提高，全球对酒精的消费日益增加。然而，过量或长期饮酒会影响中枢神经系统、肝脏、心脏及胃肠等全身多处重要组织器官的正常结构和功能，其中胃黏膜损伤便是饮酒导致的最直接的组织损伤。胃黏膜是胃组织中一道由上皮层、固有层及黏膜肌层构成的屏障保护层，其中由胃黏膜上皮细胞构成的上皮层完整性对于维持胃黏膜屏障以减轻乙醇（酒精）等外来攻击因子对胃组织的破坏具有重要作用。研究表明，酒精的这种破坏作用主要是其进入胃黏膜上皮细胞后促使细胞发生严重的氧化应激反应，导致细胞产生不可逆的生长抑制作用，甚至凋亡。若不及时对酒精的这种破坏作用进行干预，正常胃黏膜组织就会由浅表性胃炎发展为胃溃疡或胃糜烂，最终甚至形成癌变，严重威胁人体健康，同时也给全球经济、医疗带来极大的负担。目前对于胃黏膜损伤的临床治疗药物主要有铝制剂以及铋剂等，它们可以在细胞表面形成保护层，阻止胃酸、胃蛋白酶对其进行进一步的损伤，但并不具备帮助受损组织修复的功能。因此，研究和开发天然资源中具备养胃、护胃功效的营养成分，对于降低饮酒导致的胃部相关疾病的发病率具有重要意义。

谷子（）又称粟、小米，属一年生禾本科植物，是山西地区的主要农作物之一，营养价值丰富。谷子脱下来的皮壳称谷糠，《黄帝内经》认为谷糠“功同米而优于米，补而不滞，温而不燥”，对于脾胃具有诸多益处。现代研究发现，以全谷物为主要原料的面食或发酵醋中掺入谷糠后，具有明显的健胃功效，表明谷糠中可能含有健胃、护胃的功能成分，但目前对其具体发挥作用的成分、机制尚不清楚。植物多酚是存在于植物体内的一种复杂的次生代谢产物，是以苯环的多羟基取代为特征的一类植物化学物质的总称。大量研究表明，植物多酚对胃黏膜具有重要的保护和修复作用，可以预防酒精对人胃黏膜上皮细胞株以及大鼠胃黏膜的损害。同时，植物多酚能够通过减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、抑制脂质过氧化等作用缓解氧化应激反应，促进细胞存活，抑制细胞凋亡。近年来，国内外学者对谷子中的多酚类化合物进行了鉴定，发现谷子中富含多酚，且主要富集于谷子的皮壳——谷糠。因此推测，谷糠多酚很有可能具有养胃、护胃功能，而且主要是通过清除ROS来发挥功能。

本课题组前期从谷糠中提取并鉴定了谷糠内壳结合态多酚类物质（bound polyphenol of inner shell，BPIS）。本研究通过连续3 周对Wistar大鼠灌胃BPIS进行干预，采用BPIS干预结束后灌胃75%（体积分数，下同）乙醇溶液（剂量为10 mL/kg）构建急性胃黏膜损伤模型，分析BPIS对胃黏膜损伤的预防作用，从组织形态及组织病理学水平分析胃黏膜损伤情况；同时采用1 000 mmol/L酒精处理人胃黏膜上皮细胞（GES-1）12 h的方式构建酒精性GES-1细胞损伤模型，从细胞活力及形态方面观察BPIS对GES-1细胞的保护作用。最后以大鼠胃黏膜组织和GES-1细胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）、凋亡相关蛋白（Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9蛋白）相对表达水平及GES-1细胞中ROS水平为指标，分析BPIS保护胃黏膜的分子机制。本实验以谷糠多酚为试材，为改善酒精性胃黏膜损伤的研究提供参考，同时为开发具有养胃、护胃特性的功能食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性Wistar大鼠由上海交通大学医学院实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK（沪）2018-0027。

GES-1细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

谷糠 山西省天下谷有限公司；将谷糠原材料破碎后过60 目筛，室温下密封保存备用。丙酮和乙酸乙酯（均为分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；青链霉素、福林-酚试剂、吐温20、十二烷基硫酸钠-聚凝胶电泳丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂、抗荧光衰减封片剂索莱宝（北京）科技有限公司；RPMI-1640培养基中国BI公司；胎牛血清 中国四季青公司；免疫染色固定液、细胞裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；MDA和SOD试剂盒 南京建成生物工程研究所；ROS测定试剂盒 江苏凯基生物技术公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

二氧化碳培养箱 德国Eppendorf公司；倒置荧光显微镜 德国ZEISS公司；超纯水机 四川沃特尔水处理设备有限公司；精密电子天平 美国OHAUS仪器有限公司；恒温箱 德国Memmert有限公司；低速离心机中国中科中佳科学仪器有限公司；Delta Vision Elite活细胞工作站 美国General Electric公司。

1.3 方法

1.3.1 BPIS的提取制备与动物分组

参考本课题组前期提取方法制得BPIS冻干粉。将BPIS冻干粉用一定体积的蒸馏水溶解后，以没食子酸为标准品制作标准曲线，利用福林-酚法检测溶解后的样品中多酚质量分数为（2.6±0.4）%。

本课题组前期利用AOM/DSS构建C57BL/6J结肠癌小鼠模型，同时通过隔天灌胃150 mg/kg谷糠多酚进行干预，3个月后发现裸鼠肿瘤的质量明显降低，存活率明显增加，且该剂量对裸鼠主要脏器心、肝、脾、肺、肾、胰腺没有明显的毒副作用。因此本研究中选用的剂量（每天灌胃50 mg/kgBPIS）是安全可行的。

30 只雄性Wistar大鼠（体质量200～250 g）在相对湿度50%～60%、温度23～25 ℃的动物房适应性喂养1 周，给予正常饮食。1 周后，将大鼠随机分为对照组、模型组、BPIS干预组，每组10 只。每日上午9时进行灌胃处理，其中对照组与模型组大鼠给予生理盐水（1 mL/100 g），BPIS干预组给予50 mg/kg的BPIS，持续3 周。每隔1 d记录各组Wistar大鼠体质量，每隔4 d记录大鼠摄食量。灌胃最后一天晚上大鼠禁食不禁水。次日早晨模型组与BPIS干预组均灌胃75%酒精（剂量为10 mL/kg），对照组给予相同剂量的生理盐水。4 h后，采用10%（质量分数）水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后脱颈处死大鼠。将大鼠开腹取胃，沿胃大弯剪开，用预冷的生理盐水将胃黏膜内容物清洗干净后用滤纸吸干，将胃内壁翻出观察胃黏膜的损伤情况并拍照记录，然后将胃黏膜组织置于-80 ℃冷冻保存待用。

1.3.2 大鼠胃黏膜损伤指数测定

参考文献[23]测定大鼠的胃黏膜损伤指数。利用电子卡尺测量大鼠胃黏膜损伤部位，按照文献[23]对条状损伤与片状损伤进行评分后计算每只大鼠的胃黏膜损伤指数（Guth标准）。

1.3.3 大鼠胃黏膜组织观察

参考文献[24]将各组大鼠胃黏膜组织用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后，置于倒置显微镜下观察。以Mascuda标准计算大鼠的胃黏膜病理学损伤指数，每一张石蜡切片的损伤累积评分不超过15 分。

1.3.4 GES-1细胞酒精损伤模型及BPIS干预模型的建立

GES-1细胞用含有10%（体积分数）胎牛血清与1%（体积分数）青链霉素的RPMI-1640培养基（即完全培养基）培养，培养条件为5%（体积分数）CO、37 ℃的培养箱。收集对数生长期的细胞，用1×胰蛋白酶溶液消化（25 cm培养瓶约加入0.5 mL胰蛋白酶溶液）后，加入等体积的完全培养基终止消化，800 r/min离心5 min后弃去上清液，用1 mL完全培养基重悬细胞，随后用血球计数板计数。用新鲜的完全培养基调整细胞浓度为1×10个/mL，按照每孔200 μL加入96 孔培养板中培养12 h。待细胞贴壁后，吸弃培养液，每孔加入200 μL含酒精（乙醇终浓度分别为0、100、200、400、800、1 000 mmol/L）的完全培养基，分别作用于GES-1细胞6、12 h后，吸弃培养液。参考文献[21]采用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法测定细胞存活率。

按照上述方法利用含BPIS（终质量浓度分别为0、1、5、10、15、20 μg/mL）的完全培养基孵育GES-1细胞24、48、72 h，利用MTT法测定细胞存活率。

按照上述方法利用含BPIS（终质量浓度分别为0、1、5、10、15 μg/mL）的完全培养基孵育GES-1细胞24 h，然后弃去培养液，加入含酒精（终浓度1 000 mmol/L）的完全培养基继续孵育12 h，对照组添加等体积分完全培养基。处理结束后采用MTT法测定细胞存活率，并在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.3.5 GES-1细胞内活性氧水平的测定

将对数生长期的GES-1细胞按照500 μL/孔接种于24 孔板（细胞浓度为1×10个/孔）。BPIS干预组按照1.3.4节方法用500 μL含15 μg/mL BPIS的完全培养基孵育24 h后，吸弃培养液后，再加入500 μL酒精浓度为的1 000 mmol/L的完全培养基继续孵育12 h。对照组均添加等体积的完全培养基，模型组以等体积的完全培养基替代含15 μg/mL BPIS的完全培养基。孵育结束后吸弃培养液，每孔分别加入500 μL 5 μmol/L活性氧荧光探针2,7-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluor escein diacetate，DCFH-DA）试剂，37 ℃下共孵育进行荧光探针装载。按照ROS测定试剂盒说明书进行制片观察，利用Image J软件计算DCFH-DA荧光强度以表征ROS水平。

1.3.6 GES-1细胞和大鼠胃黏膜组织生化指标的测定

将对数生长期的GES-1细胞按照2 mL/孔接种于6 孔板，细胞浓度为4×10个/孔，按照1.3.5节方法处理细胞。收集各组处理结束后的细胞，加入适量1×磷酸缓冲液（pH 7.2）清洗，然后经液氮反复冻融裂解细胞，12 000 r/min离心15 min收集上清液备用。相似的，将1.3.1节各组大鼠胃黏膜复温后吸去水分，进行研磨，用生理盐水制成质量分数10%的组织匀浆液，3 000 r/min离心15 min，收集上清液备用。取上述样品分别按照试剂盒说明书测定SOD活力及MDA含量。

1.3.7 蛋白相对表达量的测定

取1.3.6节中制备的上清液进行实验。参考文献[20]，采用蛋白质免疫印迹法检测GES-1细胞及胃黏膜组织中调亡相关蛋白（Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9蛋白）相对表达量。

1.4 数据处理与分析

结果中的数据均为3 次独立实验所得，实验结果用平均值±标准差表示。采用SPSS软件进行单因素方差分析，采用最小显著差异检验（least significant difference，LSD检验）进行显著性分析，＜0.05表示差异显著，＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 BPIS对饲养过程中Wistar大鼠体质量及摄食量的影响

随着饲养时间的延长，各组别大鼠体质量逐渐增加，但组间无显著差异（＞0.05）（图1A）；在各组别中，平均每只大鼠每日摄食量虽有所变化，但其数值上不存在统计学差异（＞0.05）（图1B）。

图1 BPIS对Wistar大鼠体质量（A）及摄食量（B）的影响Fig. 1 Effect of foxtail millet bran polyphenols on body mass (A) and food intake (B) of Wistar rats

2.2 BPIS对酒精诱导的大鼠胃黏膜损伤的影响

干预结束后，对照组大鼠的胃黏膜组织颜色淡红，表面光滑有弹性，褶皱完整且走向规则（图2A）；与对照组相比，模型组大鼠的胃黏膜出血严重，部分皱襞减少甚至消失（图2B）；与模型组相比，BPIS干预组黏膜皱襞完整，出血性损伤明显较少（图2C）。参照Guth标准对胃黏膜损伤指数进行测定，结果显示：对照组、模型组、BPIS干预组的胃黏膜损伤指数平均值分别为0、104.8、30.9（图2D）。以上结果表明，BPIS明显改善了酒精诱导的大鼠胃黏膜损伤。

图2 BPIS对酒精诱导的大鼠胃组织形态的影响Fig. 2 Effect of foxtail millet bran polyphenols on rat gastric morphology induced by ethanol in mice

2.3 BPIS对酒精诱导的大鼠胃黏膜损伤的组织病理学分析结果

Wistar大鼠胃部组织HE染色结果显示：对照组大鼠胃黏膜上皮结构完整，腺体排列整齐，黏膜层、黏膜下层和肌肉层结构完整、层次清晰，未见明显水肿及炎症细胞浸润（图3A）。模型组大鼠胃黏膜组织正常结构消失，上皮细胞排列无序且大量死亡，有明显的炎症细胞浸润，黏膜下层水肿，但损伤未累及黏膜肌层（图3B）。与模型组相比，BPIS干预组的大鼠胃黏膜组织结构完整，腺体细胞排列较为整齐，偶见细胞脱落，但黏膜下层没有明显的水肿，与正常的胃组织结构较为接近（图3C）。随后利用Mascuda评分标准对各组胃黏膜损伤指数进行评价，结果显示：对照组，模型组，BPIS干预组的胃黏膜损伤指数平均值分别为0、8.8、2.0（图3D）。以上结果进一步表明提前摄入BPIS对酒精引起的胃黏膜损伤有明显的预防作用。

图3 BPIS对酒精诱导的大鼠胃黏膜组织病理学的影响Fig. 3 Effect of foxtail millet bran polyphenols on rat gastric mucosa histopathology induced by ethanol in mice

2.4 BPIS对酒精诱导的GES-1细胞活性的影响

首先通过MTT实验确定GES-1细胞的酒精造模浓度、时间及BPIS作用质量浓度，如图4A所示，当1 000 mmol/L酒精作用12 h时，GES-1细胞存活率低于50%，故选用此条件作为细胞造模条件；随后利用不同质量浓度的BPIS分别孵育GES-1细胞24、48、72 h，发现BPIS在72 h内对细胞没有明显的毒副作用（图4B）。进一步选择1、5、10、15 μg/mL BPIS预处理细胞24 h后，1 000 mmol/L酒精继续作用12 h，观察BPIS对GES-1细胞活力的影响，结果表明，BPIS能够明显改善酒精引起的GES-1细胞存活率降低的现象且呈剂量依赖性（图4C）。因此，选择15 μg/mL BPIS孵育GES-1细胞24 h作为后续BPIS干预组的处理条件。

图4 BPIS对酒精诱导的GES-1细胞存活率的影响Fig. 4 Effect of foxtail millet bran polyphenols on survival rate of gastric epithelial cells induced by ethanol

进一步对GES-1细胞进行形态学观察发现，对照组细胞状态良好，呈上皮细胞样，结构边缘清晰，贴壁牢固（图5A）；模型组细胞形态明显变小变圆，部分细胞呈现漂浮状态（图5B）；BPIS干预组细胞形态结构完整，趋于上皮细胞样，基本完全贴壁（图5C）。说明BPIS对酒精诱导的GES-1细胞有明显的保护作用。

图5 BPIS对酒精诱导的GES-1细胞形态的影响Fig. 5 Effect of foxtail millet bran polyphenols on morphology of gastric epithelial cells induced by ethanol

2.5 BPIS对酒精诱导的大鼠胃黏膜组织和GES-1细胞氧化应激的影响

ROS包括氧自由基、羟自由基、HO等，细胞ROS水平是衡量细胞氧化程度的重要标志。如图6所示，GES-1细胞经酒精处理后，细胞内ROS水平极显著升高（＜0.01），约为对照组的1.7 倍；与模型组相比，经BPIS预处理的细胞ROS水平极显著降低（＜0.01），表明BPIS能够明显缓解酒精引起的细胞氧化损伤程度。

图6 BPIS对酒精诱导GES-1细胞ROS水平的影响Fig. 6 Effect of foxtail millet bran polyphenols on ROS level of gastric epithelial cells induced by ethanol

MDA是ROS在机体生物膜发生的脂质过氧化反应产物，其含量能够反映脂质过氧化的程度。SOD是与机体氧化应激水平相关物质，其活力能够反映机体清除自由基的能力，是细胞抵抗氧化损伤的重要防线。如图7A、B所示，与对照组相比，灌胃酒精后的模型组大鼠胃黏膜组织中MDA含量极显著增加（＜0.01），SOD活力极显著降低（＜0.01）；而与模型组相比，BPIS干预组大鼠胃黏膜中MDA含量极显著降低（＜0.01），SOD活力极显著增加（＜0.01）。如图7C、D所示，与对照组相比，GES-1细胞经酒精处理后，MDA含量极显著升高（＜0.01），SOD活力极显著下降（＜0.01）；与模型组相比，经BPIS处理的GES-1细胞氧化应激水平有所改善，MDA含量极显著降低（＜0.01），SOD活力极显著升高（＜0.01）。

图7 BPIS对酒精诱导大鼠胃黏膜组织和GES-1细胞的MDA含量和SOD活力的影响Fig. 7 Effect of foxtail millet bran polyphenols on MDA content and SOD activity of rat gastric mucosa and gastric epithelial cells induced by ethanol

2.6 BPIS对酒精诱导的大鼠胃黏膜组织和GES-1细胞中调亡相关蛋白的影响

如图8所示，与对照组相比，模型组大鼠胃黏膜组织和GES-1细胞中Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9蛋白相对表达水平明显上调；与模型组相比，BPIS处理可以明显抑制Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白的活化。

图8 BPIS对酒精诱导的大鼠胃黏膜和GES-1细胞中Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9蛋白表达的影响Fig. 8 Effects of foxtail millet bran polyphenols on cleaved caspase-3,cleaved caspase-8 and cleaved caspase-9 expression levels in rat gastric mucosa and gastric epithelial cells induced by ethanol

3 讨 论

动物实验是研究酒精性胃黏膜损伤的常用方法，本研究采用了75%酒精灌胃雄性Wistar大鼠的方式构建急性胃黏膜损伤模型，观察BPIS连续灌胃3 周对大鼠胃黏膜损伤的预防作用，发现模型组大鼠的胃黏膜出血严重，这与Zhang Jing、Chen Yi等的研究结果一致；与模型组相比，BPIS干预组黏膜皱襞完整，出血性损伤明显较少，损伤指数均极显著低于模型组（＜0.01），说明BPIS可以明显改善酒精引起的胃黏膜出血、水肿和腺体受损等病理损伤情况。胃黏膜上皮细胞是酒精损伤的直接靶点，本研究利用1 000 mmol/L酒精处理GES-1细胞的方式构建酒精性GES-1细胞损伤模型，以细胞活力与形态结构变化作为指标，检测BPIS对GES-1细胞的保护作用，发现BPIS能够明显改善酒精引起的GES-1细胞存活率降低的现象，同时能够有效缓解酒精引起的GES-1细胞形态结构的变化。ROS在胃黏膜损伤的发病机制中扮演着至关重要的角色。酒精的摄入可刺激ROS的大量产生，促进脂质过氧化，进而对胃黏膜造成严重的损伤；不饱和脂肪酸在生物膜系统中被ROS攻击，并通过脂质过氧化转化为MDA，因此，MDA可以用来表征和量化脂质过氧化；SOD是一种重要的胞内酶抗氧化剂，是抵抗ROS的第一道防线，SOD可以保护细胞免受ROS的损伤。本研究发现酒精会大幅降低大鼠胃黏膜组织和GES-1细胞中SOD活力，增加MDA水平，增加GES-1细胞中ROS水平；而BPIS处理可以极显著增加大鼠胃黏膜组织和GES-1细胞SOD的活力（＜0.01），抑制MDA的产生。由此可知，谷糠多酚是谷子中发挥干预酒精性胃黏膜损伤的重要有效成分，其潜在机理在于能够缓解酒精引起的ROS水平升高从而减轻GES-1细胞的氧化应激反应。

由于谷糠口感粗糙，在粮食精细加工的过程中往往被丢弃，目前谷糠主要用于畜禽饲料，产品附加值很低。现代研究发现，谷糠虽仅占谷子质量的5%～7%，却集中了谷子中绝大部分的营养素。尤其是对人体健康有益的多酚类物质主要富集于谷糠，占小米总酚酸的近70%（质量分数）。谷子的主要食用部位——小米，由于富含糖类、蛋白质和脂质，倾向于为人类提供基本营养；而谷糠中的次级代谢产物则更倾向于发挥保健和医药功能。本课题组前期研究表明，谷糠多酚中包含12种主要活性成分，分别为阿魏酸、异阿魏酸、对-香豆酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、二聚体阿魏酸衍生物、二聚体肉桂酸衍生物、葡萄糖基丁香酸、阿魏酸4----吡喃糖苷、香草酸4----吡喃糖苷和牡荆素，本实验并没有分析BPIS中具有改善酒精性胃黏膜损伤的具体活性成分，因此后期可围绕此问题展开相关研究。

综上，谷糠多酚具有明显改善酒精性胃黏膜损伤的作用，其潜在的作用机制是通过提高胃黏膜的抗氧化能力（包括提高SOD活力，降低MDA和ROS水平），增加胃黏膜上皮细胞的活性，抑制其凋亡，从而达到保护胃黏膜的作用。胃肠健康是衡量个体健康的主要指标，本研究关于BPIS对酒精性胃黏膜损伤的保护作用机制还停留在较为基础的研究阶段，以后还需在现有基础上继续深入挖掘，以期为BPIS在保护胃肠健康、缓解酒精性胃黏膜损伤功能食品的开发应用中提供更多的理论依据。