生驼乳中大肠杆菌的污染情况调查

文│张耀文（新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心）

蔡扩军（新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、新疆农业大学动物医学学院）

徐敏*（新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、乌鲁木齐市奶业协会）

新疆是我国第一大骆驼养殖基地，现有骆驼25万峰，现代科学研究表明，驼乳不但营养价值高，且富含不饱和脂肪酸、维生素等营养成分，易被消化吸收，而且含有天然胰岛素、胰岛素蛋白质等降血糖因子，对糖尿病治疗有一定功效。另外，驼奶中的乳铁传递蛋白、溶解酵素、免疫球蛋白可提高人体免疫力，是免疫力低下者的理想饮品。由于驼乳的价值逐渐被广大消费者认可，使得驼乳行业飞速发展，供不应求。但驼乳的质量安全应引起广大科研工作者的重视。

Escherich在1885年发现了大肠杆菌，又叫大肠埃希氏菌。大肠杆菌是常在的条件性人畜共患病致病菌，又是重要的食源性细菌，在一定条件下可以引起人和动物局部组织器官感染。动物产品中大肠杆菌的污染给消费者带来了安全隐患，其中乳源性大肠杆菌的危害已引起人们的极大关注，牛乳中大肠杆菌污染较多，而驼乳中大肠杆菌的污染报道极少。鉴于此，为调查本地生驼乳中大肠杆菌的污染情况，本研究利用荧光PCR快速检测方法对生驼乳中大肠杆菌的污染情况开展调查，为保障驼乳质量安全，促进驼乳产业的健康快速发展提供技术支撑。

一、材料与方法

1.主要试剂。大肠杆菌荧光PCR检测试剂盒购自深圳澳东检验检测科技有限公司；EC肉汤购自北京陆桥技术股份有限公司。

2.主要仪器。荧光PCR仪（ABI 7500型）购自美国ABI公司；生物安全柜；细菌培养箱。

3.大肠杆菌的分离、检测。

（1）样品采集。采集生鲜驼奶90份，样品放入含有冰袋的运输箱内低温运输至实验室。

（2）检验程序。

（3）操作步骤，见图1。

增菌：无菌取25毫升生驼奶样品放入三角瓶，再加入225毫升的EC肉汤，36±1℃培养18～24小时。

提取样品DNA：取1毫升菌液加到1.5毫升无菌离心管中，13000转/分离心5分钟，弃上清，加入50微升DNA提取液悬浮沉淀，充分混匀后沸水浴10分钟，13000转/分离心5分钟，离心后取上清作为DNA模板检测或保存于-20℃待检测。阴性对照参与提取，以对环境进行监控。阳性对照无需提取，直接使用。

反应组份配制：按照大肠杆菌荧光PCR检测试剂盒的说明书将样品DNA、核酸扩增反应液、反应液、HS-Taq酶加至反应管内，反应总体积为25微升，同时设置阴性和阳性对照。

PCR扩增：将配置好反应液的反应管置于荧光PCR仪器中，扩增程序为预变性95℃ 3分钟、变性95℃5秒、退火/延伸60℃ 40秒，40个循环。荧光信号采集设定在退火/延伸时。对于多通道荧光PCR仪，选择荧光素FAM为信号采集通道，淬灭基团选None，染料校正选None。

（4）结果描述及判定。

阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表示样本阴性或者被检测样本核酸浓度含量低于1×102copies/毫升。

阳性：Ct值≤30，且出现明显的指数增长期，表示样本阳性。

可疑：检测样本30＜Ct＜35时重复一次。如果Ct值仍小于35，且曲线有明显的指数增长期，可报告样本阳性，否则报告样本阴性或被检测样本核酸浓度含量低于1×102copies/毫升。

对照：阴阳性对照必须成立，否则此次实验视为无效。

二、结果

根据大肠杆菌荧光PCR检测试剂盒说明书进行结果判定，结果显示，该试验阴阳性对照成立，本批次一共检测样品90份，其中18份阳性，72份阴性，阳性率20%。

三、讨论

近年来，驼乳在疾病辅助治疗、营养保健、提高免疫力等方面的研究不断深入，越来越受到广大消费者的认可，同时驼乳的质量安全也引起了广泛关注。驼乳中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等微生物污染是影响质量安全的重要因素，大肠杆菌是环境中常在的条件性致病菌，驼乳可通过外源性污染和骆驼的内源性感染造成其携带大肠杆菌，对消费者身体健康造成影响，具有一定的公共卫生安全隐患。本研究结果显示，驼乳中大肠杆菌的阳性率为20%，虽然检出率显著低于全国牛乳中大肠杆菌检出率的平均水平，但应引起相关部门的重视。由于骆驼一般采取传统手工挤奶方式，易造成大肠杆菌的污染，建议相关部门制定骆驼挤奶技术规范，降低因挤奶不卫生而造成的外源性污染。

大肠杆菌的检测技术主要包括对核酸、繁殖代谢产物、特异性抗体等进行检测，其中针对核酸DNA的PCR技术在检测中得到广泛应用。荧光PCR方法是指在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR扩增的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比增加，最后通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图，对PCR进程进行实时检测。本研究利用荧光PCR技术，其操作方便快捷，具有较强的特异性和较高的灵敏度，实现了对生驼奶中大肠杆菌的快速检测，为生驼乳中大肠杆菌的污染调查提供了技术支持。