青光安Ⅱ号方对DBA/2J 小鼠视网膜中Rho/ROCK 相关因子的影响

时 健，彭 俊，姚小磊，孙嘉桧，李银鑫，彭清华

（1. 湖南中医药大学，湖南长沙 410208；2. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410208；3. 广西中医药大学第一附属医院，广西南宁 530022；4.中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室，湖南长沙 410208）

青光眼作为目前不可逆眼部疾病的第一位，2040 年全球原发性青光眼患病人数超过1.118 亿［1］。中国青光眼患者是目前全球青光眼患者人数最多的国家，我国40 岁及以上的总患病率为2.3%～3.6%，其中54.9%～82.0% 的青光眼患者未被诊断，6.3%～14.1%的青光眼患者双眼致盲［2］，研究表明，72%的青光眼患者在就医时已是晚期［3］。而控制眼压是临床上保存视力的较为重要的方式，但眼压稳定后，视力依旧出现下降的情况，这就是青光眼导致的视神经损伤。前期研究已经表明青光安Ⅱ号方可能抑制Rho/ROCK 信号通路从而保护视网膜的作用［4］，但其仅蛋白水平进行验证，所以本次研究通过q⁃PCR 技术，从基因层面进一步验证其是否通过抑制Rho/ROCK 信号通路，进而保护DBA/2J 小鼠视网膜的作用。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 取48 只健康DBA/2J 小鼠，质量18～22 g，SPF 级，雌性，10 周龄，许可证号：SCXK（京）2016⁃0006，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；8 只C57BL/6J 小鼠，质量18～22 g，SPF级，雌性，10 周龄，许可证号：SCXK（湘）2016⁃0002，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。伦理批准编号：LL20191008021。

1.1.2 实验药物 青光安Ⅱ号方汤剂：由枸杞（生产批号：SL19112203）、牛膝（ 生产批号：CK19101401）等用灭菌蒸馏水按规定比例煎煮；益脉康分散片（湖南湘雅制药有限公司，批号：1903119）；青光安Ⅱ号方有效组分：是基于中药高通量筛选体系［5］对青光安Ⅱ号方中药组分进行筛选，提取出青光安Ⅱ号方有效组分。

1.1.3 主要试剂与仪器 RNA 提取液（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：G3013）；三氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司，货号：10006818）；异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，货号：8010921）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，货号：10009218）；HyPureTMMolecular Biology Grade Wa⁃ter（HyClone，货号：SH30538.02）；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo，货 号 ：#K1622）；Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：4913850001）。

匀浆仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号：KZ⁃Ⅱ）；台式高速冷冻型微量离心机［大龙兴创实验仪器（北京）股份公司，型号：D3024R］；荧光定量PCR 仪（赛默飞，型号：Stepone plus）；超净工作台（苏净安泰，型号：SW⁃CJ⁃1FD）；超微量分光光度（赛默飞，型号：NanoDrop2000）；标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司，型号：FBZ2001⁃up⁃p）。

1.1.4 引物 引物合成公司：武汉赛维尔生物科技有限公司。引物序列见表1。

表1 引物序列表Tab 1 Primer sequence

1.2 实验方法

1.2.1 动物及分组 将48 只DBA/2J 小鼠按照随机数字表法随机分为6 组，每组8 只，设为模型组、益脉康分散片组、青光安Ⅱ号汤剂组、青光安Ⅱ号方有效组分低、中、高浓度组，同时使用8 只C57BL/6J 小鼠作为空白组。

1.2.2 模型建立 根据文献［6］，DBA/2J 小鼠喂养至38 周龄自动形成青光眼模型。观察DBA/2J 小鼠眼压及眼前节变化，确定是否形成青光眼模型。

1.2.3 给药方式 待模型成立且稳定后，开始灌胃，每日1 次，连续4 周。通过人/动物体表面积等效剂量比值表计算成人等效剂量。空白组和模型组予以等效剂量蒸馏水；益脉康分散片组予以等效剂量（0.31 g·kg⁃1·d⁃1）益脉康分散片悬混液；青光安Ⅱ号汤剂组予以等效剂量（9.67 g·kg⁃1·d⁃1）青光安Ⅱ号方汤剂；青光安Ⅱ号方有效组分低、中、高浓度组组分别予以成人等效剂量的1/2 倍、1 倍、2 倍（0.85、1.70、3.40 g·kg⁃1·d⁃1）青光安Ⅱ号方有效组分悬混液。

1.3 取材与检测

将各组小鼠行处死，取出眼球，除去眼前节及玻璃体，迅速剥离出视网膜组织，低温保存，供q⁃PCR 检测。

1.3.1 眼压检测 使用Tono⁃pen AVIA 接触式眼压笔，取连续10 次测量的平均值（且LCD 上显示置信指标≥95）作为当周该眼眼压值，每4 周测1 次，从第10 周开始，待到DBA/2J 小鼠眼压升高以及趋于稳定后停测。

1.3.2 眼前节检测 所有动物适应性喂养3 d 后接受眼前段裂隙灯检查，每4 周检查1 次。由3 位固定的实验人员在检查室内进行操作完成，一位负责将小鼠托举在裂隙灯颌架装置适当高度位置，一位负责调节焦距，通过目镜观察小鼠眼前段情况，观察部位包括角膜、虹膜、前房、瞳孔、晶状体等，一位负责电脑拍照。

1.3.3 q⁃PCR 检测RhoA mRNA、ROCK mRNA、Caspase⁃3 mRNA 及Bcl⁃2 mRNA 转录的表达 （1）RNA 抽提：在匀浆管中，加入1 mL 的Trizol Re⁃agent，置于冰上预冷，加入100 mg 组织，使用匀浆仪充分研磨，12 000 r/ min 离心10 min，取上清，加入250 μL 三氯甲烷，混匀后静置3 min，1 2000 r/min 离心10 min，将上清液转移到新的离心管中，加入0.8 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，−20 ℃放置15 min，12 000 r/min 离心10 min。吸除液体，加入75% 乙醇1.5 mL 洗涤沉淀，12 000 r/min 离心5 min，吸出液体，将离心管置于超净台上吹3 min，加入15 μL 无RNA 酶的水溶解RNA，55℃孵育5 min，使用Nanodrop 2000 检测RNA 浓度及纯度。将浓度过高的RNA 进行适当比例的稀释，使其终浓度为100～500 ng/μL。（2）反转录：取一PCR 管，加入含10 μL RNA 和1 μL oligo（dT）18，用无核糖核酸酶的去离子水补足至12 μL，于PCR 仪上65 ℃保温5 min，迅速置冰上冷却，依次加入4 μL 5×Reaction Buffer，2 μL10 mmol/L dNTP Mix，1 μL RiboLock RNAase 抑制剂（20 U/μL）和1 μL RevertAi M⁃MuLV 逆转录酶（200 U/μL），混匀，于PCR 仪上42 ℃保温60 min，结束后70 ℃保温5 min 灭活反转录酶。（3）定量PCR：取0.2 mL PCR 管，加入2×qP⁃CR Mix（12.5 μL），7.5 μmol/L 基因引物（2.0 μL），反转录产物（2.5 μL），ddH2O（8.0 μL），3 管。PCR扩增：预变性（95 ℃10 min），循环（40 次95 ℃15 s→60 ℃60 s），熔解曲线（60℃→95 ℃每15 s 升温0.3 ℃），（4）结果处理：2⁃△△Ct法：△Ct 试验=Ct 目的−Ct 内参，△Ct 对照=Ct 目的−Ct 内参；△△Ct=△Ct 实验−△Ct 对照；相对表达量=2⁃△△Ct。

1.4 统计学处理

用SPSS26.0 统计学软件进行数据分析，行双侧检验，P<0.05 为差异有统计性意义。计量资料用（±s）表示。进行正态性和方差齐性检验，若数据呈正态分布，进行单因素方差分析或校正单因素方差分析。采用Tukey法进行多组比较。若不满足正态性要求，则采用非参数检验。

2 结果

2.1 眼压结果

C57BL/6J 小鼠眼压持续稳定，持续波动在11～14 mmHg，DBA/2J 小鼠眼压从第10 周龄开始持续升高，38 周龄时达到（23.41±2.26）mmHg［4］，已形成高眼压型小鼠模型，从第14 周开始，空白组眼压与其他组眼压比较，差异有统计学意义（P<0.05），18 周以后眼压差异较大，具有统计学意义（P<0.01）。见图1。

图1 C57BL/6J 小鼠与DBA/2J 小鼠不同时间点眼压比较Fig 1 IOP comparison at different time points between C57BL/6J mice and DBA /2J mice

2.2 眼前节检测

C57BL/6J 小鼠眼前节无明显变化（图2A、B），DBA/2J 小鼠10 周龄时即出现角膜钙化（图2C）；且角膜钙化加重，出现虹膜色素脱失播散，局部出现虹膜透照，虹膜基质萎缩，瞳孔后粘连，到38 周龄时虹膜色素脱失加重，瞳孔移位，部分并发白内障（图2D）。

图2 C57BL/6J 小鼠与DBA/2J 小鼠不同周龄眼前节情况Fig 2 Anterior segment of C57BL/6J mice and DBA/2J mice at different ages

2.3 q⁃PCR 检测结果

在RhoA mRNA 的转录中，与空白组相比，其它6组的相对表达量均升高，但模型组、益脉康分散片组及青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比较，其它6 组的相对表达量均低于模型组，仅青光安Ⅱ号方汤剂组和青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组差异有统计学意义（P<0.05）；青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组与青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组差异有统计学意义（P<0.05），其它无统计学差异（P>0.05）。在ROCK mRNA 的转录中，与空白组比较，除高浓度组以外，其它5 组相对表达量明显升高，但仅模型组、益脉康分散片组及青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组差异有统计学意义（P<0.05）；模型组的ROCK mRNA 转录高于其它6 组，与青光安Ⅱ号方有效组分中、高浓度组差异有统计学意义（P<0.05）；青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组与益脉康分散片组差异有统计学意义（P<0.05），其它无统计学差异（P>0.05）。见表1。

表1 不同组RhoA mRNA 和ROCK mRNA 相对表达量比较（n=3，±s）Tab 1 Comparison of RhoA mRNA and ROCK mRNA rela⁃tive expression in different groups（n=3，±s）

表1 不同组RhoA mRNA 和ROCK mRNA 相对表达量比较（n=3，±s）Tab 1 Comparison of RhoA mRNA and ROCK mRNA rela⁃tive expression in different groups（n=3，±s）

注：与空白组比较,*P<0.05；与模型组比较,#P<0.05；与青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组比较,△P<0.05；与青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组比较,▲P<0.05。

ROCK mRNA 1 125.20±13.13*62.79±1.30*▲47.54±1.88 52.10±2.85*25.35±6.12#9.03±0.76#19.549 0.003组别空白组模型组益脉康分散片组青光安Ⅱ号方汤剂组青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组青光安Ⅱ号方有效组分中浓度组青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组HP RhoA mRNA 1 7.30±0.83*4.21±0.25*3.71±0.30#4.83±0.12*4.06±0.70 1.97±0.12#△18.333 0.005

在Caspase⁃3 mRNA 的转录中，与空白组比较，其它6 组相对表达量均上升，仅模型组、益脉康分散片组和青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，其它6 组均下降，青光安Ⅱ号方有效组分中、高浓度组差异有统计学意义（P<0.05）；益脉康分散片组和青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组与青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组差异有统计学意义（P<0.05），其它无统计学差异（P>0.05）。在Bcl⁃2 mRNA 转录中，与空白组比较，其它6 组相对表达量均下降，模型组、青光安Ⅱ号方汤剂组和青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组差异有统计学意义（P<0.05）；青光安Ⅱ号方有效组分中、高浓度组的Bcl⁃2 mRNA 的相对表达量均高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组与青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组差异有统计学意义（P<0.05），其它无统计学差异（P>0.05）。

表2 不同组Caspase⁃3 mRNA 和Bcl⁃2 mRNA 相对表达量比较（n=3，±s）Tab 2 Comparison of relative Caspase⁃3 mRNA and Bcl⁃2 mRNA expression of different groups（n=3，±s）

表2 不同组Caspase⁃3 mRNA 和Bcl⁃2 mRNA 相对表达量比较（n=3，±s）Tab 2 Comparison of relative Caspase⁃3 mRNA and Bcl⁃2 mRNA expression of different groups（n=3，±s）

注：与空白组比较,*P<0.05；与模型组比较,#P<0.05；与青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组比较,△P<0.05；与青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组比较,▲P<0.05。

组别空白组模型组益脉康分散片组青光安Ⅱ号方汤剂组青光安Ⅱ号方有效组分低浓度组Caspase⁃3 mRNA 1 6.90±1.26*4.49±0.34*▲3.59±0.37 4.45±0.13*▲Bcl⁃2 mRNA 1 0.12±0.01*0.44±0.01 0.43±0.05*0.40±0.00*青光安Ⅱ号方有效组分中浓度组3.25±0.70#0.47±0.06#0.62±0.01#△18.068 0.006青光安Ⅱ号方有效组分高浓度组HP 1.86±0.09#19.132 0.004

3 讨论

青光眼中晚期出现不可逆的视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突缓慢而渐进地丧失是无法避免的，且在眼压控制后的情况下，仍然不能缓解，所以如何保护视神经和减少视神经凋亡是目前研究的重点。前期研究发现青光安Ⅱ号方在视神经保护中具有优势。我们之前发现青光安Ⅱ号方作用机制之一是通过抑制GSK⁃3β mRNA 的表达，进而促进β⁃catenin mRNA 表达，激活Wnt/β⁃catenin 信号通路［7］，而后上调PAX6、Ngn1、Ngn2 mRNA 的表达量［8］，从而发挥保护视神经的作用。另一种机制为青光安Ⅱ号方对NF⁃кB/HIF⁃1α 通路的改变，抑制了BNIP⁃3 和SOD，前者减弱了RGCs 的线粒体自噬，而后者使MDA 的减少［9］。当然也有可能是通过促进HSP 的表达［10］，进而保护了线粒体的功能，从而减弱视神经节细胞的线粒体自噬。

而目前所研究的青光安Ⅱ号方有效成分是基于Wnt/β⁃Catenin/Pax6 的中药高通量筛选体系进行筛选的，同时也验证了其通过Wnt/β⁃Catenin 信号通路对青光眼视神经节细胞起到保护作用［8］，所以笔者认为Wnt/β⁃Catenin 信号通路与Rho/ROCK信号通路在保护青光眼视神经作用上具有一定协同作用。研究表明玻璃体内注射Rho⁃GTPase 抑制剂C3 转移酶（BA⁃210）可提高RGC 的存活率和轴突再生［11］，同时短暂的视网膜缺血再灌注，主要是将白细胞通过血管内皮细胞浸润到神经组织中，从而导致视网膜内层神经元细胞的丢失［12］，而Rho/ROCK 信号通路主要使白细和内皮细胞紧密连接，使其减少浸润［13］。ROCK 抑制剂Y⁃27632 可促进原代RGCs⁃5 细胞系的活性，局部施用Rock/Net 抑制剂可促进视神经损伤后RGC 的存活和再生［14］。ROCK 抑制剂E212 治疗可抑制氧化应激和抗炎作用，减少RGCs 的损失［15］。Rho/ROCK 通路的失活可以促进神经突的再生［16，17］。

我国传统医学认为青光眼是气虚血瘀，脉络阻滞，致目窍失养，而玄府闭塞，使神水瘀积［18］，所以在治疗上采用益气活血利水的治法［19］。青光安Ⅱ号方侧重补肝肾之阴，同时在补益基础上，活血利水行气，气行则血行、气行亦水行，全方补通兼施，使目窍通畅、气血调和。

实验结果表明与之前的WB 结果相似［4］，发现视网膜中RhoA mRNA、ROCK mRNA、Caspase⁃3 mRNA 转录时相对表达量升高，模型组明显升高，其中青光安Ⅱ号方汤剂组和青光安Ⅱ号方有效组分高剂量组与模型组差异有统计学意义，说明青光安Ⅱ号方汤剂组和青光安Ⅱ号方有效组分高剂量组具有较明显的作用，而青光安Ⅱ号方有效组分的3 个组中，高剂量组与低剂量组差异有统计学意义，与青光安Ⅱ号方汤剂组差异无统计学意义，说明高剂量组对RhoA mRNA、Caspase⁃3 mRNA 的转录具有明显的抑制作用。而Bcl⁃2 mRNA 的相对表达量均降低，其中模型组最低，而青光安Ⅱ号方有效组分中、高剂量组与模型组差异有统计学意义，与空白组没有差异，说明两组有较为明显的作用，同时而青光安Ⅱ号方有效组分的3 个组中，高剂量组与低剂量组差异有统计学意义，与青光安Ⅱ号方汤剂组差异无统计学意义，说明青光安Ⅱ号方可以提高Bcl⁃2 mRNA 的转录，从而提高Bcl⁃2 的表达，来抑制Caspase⁃3 mRNA 的转录进而抑制Caspase⁃3。

但是笔者发现青光安Ⅱ号方有效组分中剂量组的ROCK mRNA 的表达量（25.35±6.12）与青光安Ⅱ号方汤剂组（47.54±1.88）有一定的差别，但差异无统计学意义（P=0.51），可能是因为有效成分对于ROCK mRNA 具有特定的抑制作用，而汤剂可能是因为含有的不明的成分对于有效成分有一定的抑制作用。所以根据其对于相关因子的表达量可以发现，青光安Ⅱ号方有效成分效果更好，可以为以后临床用药提供指导，通过改良剂型，以达到较好的疗效。

所以本次实验与之前的实验结果相同，表明了高浓度青光安Ⅱ号方可能是通过抑制Rho/ROCK信号通路从而减弱了视网膜细胞的凋亡。

作者贡献度说明：

时健：实验，撰写论文；彭俊：数据分析；姚小磊：指导实验；孙嘉桧：实验；李银鑫：实验；彭清华：指导与监督。

本文无任何利益冲突。