双醋瑞因纳米混悬剂的处方工艺优化

曾丽珠，林家振，朱喆，李晓芳

（广东药科大学药学院，广东 广州 510006）

双醋瑞因是骨关节炎治疗药物，可抑制引起炎症反应和代谢异常的细胞因子白细胞介素（IL-1、IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α），发挥抗炎镇痛作用，抑制软骨细胞凋亡，促进软骨修复，改善骨关节炎及相关疾病引起的疼痛和关节功能障碍等症状[1-4]。该药物水溶性差，体内溶出速率慢，目前临床上应用双醋瑞因胶囊剂生物利用度较低，且起效较慢，服用4～6周才表现明显效果，提高双醋瑞因的体内溶出速率与生物利用度成为值得研究的课题。

药物纳米混悬剂也称纳米晶药物，是通过研磨破碎或控制析晶技术，将微米级药物粒径减小至亚微米级甚至是纳米级，在稳定剂作用下形成的药物胶态分散体系[5]。药物纳米化可以有效提高体内溶出速率，增强药物的生物黏附性，促进药物吸收，为难溶性药物速效、高效制剂的研发提供广阔的前景[6-8]。近年来国外已有多个口服、注射等纳米晶药物产品上市[9]。目前药物纳米混悬剂的制备方法主要包括“top-down”（自上而下）技术、“bottom-up”（自下而上）技术以及两者组合技术[10-12]。“top-down”技术主要包括介质研磨技术和高压均质技术，均适用于实验室小规模制备纳米混悬液，筛选优化的处方工艺易于扩大规模生产。目前已上市的纳米晶药物产品中多数是应用介质研磨技术生产。研磨时药物粒子与研磨介质及其研磨室内壁发生剧烈碰撞，可粉碎药物颗粒至纳米级别。近年来，关于纳米混悬剂的微型化制备研究逐渐兴起，使用少量的药物、稳定剂以及微型仪器设备进行研究初期的处方工艺筛选，可有效减少原辅料用量，节约成本[13-15]。本研究应用微型化介质研磨法制备双醋瑞因的纳米混悬剂，应用正交设计试验优化处方工艺，为进一步进行制剂研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DF-101S集热式恒温加热磁拌器（巩义市予华仪器责任有限公司）；FA2004B电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；DGG-9123A电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；S3500-Microtrac激光粒度分析仪（美国麦奇克有限公司）；KQ2200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

双醋瑞因（质量分数＞98%，陕西森弗高科实业有限公司）；双醋瑞因对照品（质量分数＞98%，成都植标化纯生物技术有限公司）；羟丙基甲基纤维素（HPMC E5，安徽山河药用辅料股份有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS，安徽山河药用辅料股份有限公司）；氧化锆珠（直径0.2 mm，湖南瑞辰陶瓷有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30，德国巴斯夫公司）；泊洛沙姆188（poloxamer188，德国巴斯夫公司）。

2 方法与结果

2.1 双醋瑞因纳米混悬剂的制备

采用微型化介质研磨法制备双醋瑞因纳米混悬剂[15-16]。称取双醋瑞因50 mg，加入适量稳定剂，置于10 mL的西林瓶中，加入纯化水5.0 mL，直径0.2 mm的氧化锆珠15 g，磁力搅拌子2颗，以设定的转速研磨一定时间，去除氧化锆珠及磁力搅拌子，即制得双醋瑞因纳米混悬剂。

2.2 双醋瑞因纳米混悬剂粒度分析

取适量双醋瑞因纳米混悬液，用纯化水稀释至适宜浓度，用激光粒度分析仪测定粒径和多分散指数（polydispersity index，PDI）。

2.3 双醋瑞因纳米混悬剂处方工艺单因素考察

2.3.1 稳定剂种类考察 选用高分子聚合物HPMC E5、SDS、PVP K30及poloxamer 188分别作为稳定剂，固定稳定剂质量浓度为0.2%，转速1 200 r/min，不间断研磨3 h，制备双醋瑞因纳米混悬剂。以粒径及PDI为指标，考察不同种类的稳定剂对制备纳米混悬剂的影响，结果见图1。可见，以HPMC E5和SDS为稳定剂时制得纳米混悬剂的粒径较小，室温放置24 h后几种纳米混悬体系均出现不同程度的聚沉现象。为进一步降低PDI，增加体系的稳定性，将立体稳定型稳定剂HPMC与静电稳定型稳定剂SDS联合应用，进一步考察纳米混悬剂的质量。

图1 单一稳定剂对粒径和PDI的影响Figure 1 Effect of single stabilizer on particle size and PDI

2.3.2 混合稳定剂组成考察 按照“2.1”项下方法制备双醋瑞因纳米混悬剂，转速为1 200 r/min，研磨3 h，混合稳定剂（HPMC E5与SDS的质量比为2∶1）质量浓度为0.5%，考察HPMC E5与SDS的质量比分别为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1时对纳米混悬剂粒径和PDI的影响，结果见图2。可见，HPMC E5与SDS的质量比为2∶1时PDI最优，室温放置24 h无明显聚沉现象，纳米混悬剂稳定性提高。

图2 HPMC E5与SDS质量比对粒径和PDI的影响Figure 2 Effect of mass ratio of HPMC E5 to SDS on particle size and PDI

2.3.3 稳定剂用量考察 按照“2.1”项下方法制备双醋瑞因纳米混悬剂，转速1 200 r/min，研磨时间3 h，混合稳定剂（HPMC E5与SDS的质量比为2∶1）质量浓度分别为0.1%、0.3%、0.5%、1.0%，考察稳定剂用量对纳米混悬剂粒径和PDI的影响，结果见图3。可见，随着稳定剂用量的增加，纳米混悬剂的PDI呈下降趋势，混合稳定剂质量浓度为0.3%，纳米混悬剂粒径和PDI较小；当稳定剂质量浓度为1.0%时，粒径及PDI均有增加。

图3 稳定剂用量对粒径和PDI的影响Figure 3 Effect of stabilizer concentration on particle size and PDI

2.3.4 研磨时间考察 按照“2.1”项下方法制备双醋瑞因纳米混悬剂，称取双醋瑞因50 mg，混合稳定剂的质量浓度为0.5%，转速为1 200 r/min，分别控制研磨时间为1、1.5、2、2.5、3.0、3.5、4 h，考察研磨时间对纳米混悬剂粒径和PDI的影响，结果见图4。可见，随着研磨的时间延长，纳米混悬剂粒径和PDI均明显降低；研磨时间超过3 h，纳米混悬剂粒径和PDI呈上升趋势；较适宜的研磨时间为2～3 h。

图4 研磨时间对粒径和PDI的影响Figure 4 Effect of milling time on particle size and PDI

2.3.5 研磨速度考察 按照“2.1”项下方法制备双醋瑞因纳米混悬剂，研磨时间3 h，混合稳定剂质量浓度0.5%，设置磁力搅拌器转速分别为700、1 200、1 700 r/min，考察研磨速度对纳米混悬剂粒径和PDI的影响，结果见图5。可见，在考察范围内，随着转速增加，纳米药物粒径和PDI均明显降低，转速为1 700 r/min时稍有增大，表明研磨速度也是影响微型介质研磨法制备纳米混悬剂的主要因素。

图5 研磨转速对粒径和PDI的影响Figure 5 Effect of milling speed on particle size and PDI

2.4 正交设计试验优化处方工艺

在单因素考察的基础上，应用正交试验设计进一步优化处方工艺。将主要影响因素研磨时间设为A，转速设为B，混合稳定剂浓度（HPMCE5与SDS质量比为2∶1）设为C，采用L9（34）正交表进行正交试验设计。以粒径和多分散指数PDI为评价指标，采用综合加权评分法对实验结果进行评判。粒径（D）和多分散指数PDI（P）权重系数均为0.5，数值最大项评为0分，数值最小项评为50分，综合评分S=50×（Dmax-D）/（Dmax-Dmin）+50×（Pmax-P）/（Pmax-Pmin）。评分越高表示粒径越小，粒度分布越窄，粒子大小均匀。

正交试验设计因素水平见表1，试验结果表2、表3。方差分析结果表明，研磨时间与转速对纳米混悬剂粒径与粒度分布的影响有统计学意义（P＜0.05），稳定剂因素的影响无统计学意义。最佳处方工艺组成为A2B3C2，即研磨时间为2 h，转速为1 700 r/min，混合稳定剂浓度为0.5%。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 L9（34）正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.5 双醋瑞因纳米混悬剂制备工艺的验证

按照正交设计优化筛选得出的最优处方工艺，制备3批双醋瑞因纳米混悬剂，以粒径、PDI为指标验证制备工艺。测得3批纳米混悬剂粒径为（214.1±4.0）nm，RSD为1.8%；PDI为（0.163±0.006），RSD为3.4%；Zeta电位为（-19.18±3.24）mV。制得双醋瑞因纳米混悬剂粒径较小，粒度分布窄，纳米混悬剂于室温下放置1周稳定性较好，未观察到粒子聚沉现象。表明优化的双醋瑞因纳米混悬剂制备工艺稳定可行，重现性良好。

3 讨论

纳米混悬剂是高度分散的多相体系，拥有巨大的表面积和表面自由能，易发生聚结、晶体长大、沉降等不稳定现象。粒径与粒度分布（PDI）是评价纳米分散体系物理稳定性的重要指标。粒径分布窄的纳米分散体系，微粒间饱和溶解度差减小，从而抑制奥斯瓦尔德熟化发生，体系稳定性好。本研究应用正交试验设计优化双醋瑞因纳米混悬剂处方工艺，综合考量粒径和PDI对纳米分散体系物理稳定性的影响，采用两者综合加权评分法评判结果。

稳定剂在纳米混悬剂制备中起重要作用，适宜的稳定剂能吸附到粒子表面，产生空间立体稳定或静电稳定作用，有效阻止粒子的聚集，保持纳米分散体系的物理稳定性。不同药物结构及理化性质、表面能，稳定剂的性质，稳定剂与药物之间的作用等对纳米混悬体系的形成与稳定产生影响，需通过试验筛选合适的稳定剂[17-19]。空间稳定剂和静电稳定剂联合应用，可产生协同作用，提供足够大的粒子间排斥力，纳米混悬剂的Zeta电位绝对值约20 mV就能维持体系稳定[20]。双醋瑞因具有较强的疏水性，本文结果显示阴离子表面活性剂SDS以及亲水性高分子HPMC E5对双醋瑞因有较好的亲和性与稳定作用，制备的纳米混悬剂粒径较小。两者联用，当混合稳定剂质量浓度为0.5%、HPMC E5与SDS质量比为2∶1时，制备的双醋瑞因纳米混悬剂粒径分布较窄，PDI值减小，Zeta电位适宜，室温下不易发生聚沉，体系稳定性提高。

本文结果显示，研磨时间、转速是影响微型介质研磨法制备纳米混悬剂的主要工艺因素。研磨时间延长、转速增加，有利于将药物粒子破碎成纳米级别微粒，稳定剂有足够时间吸附到药物表面发挥作用。研磨时间过长、转速过快，将导致药物粒子之间碰撞加剧，粒子聚集可能性增加，粒径及PDI增大。研磨过程中，氧化锆珠之间发生剧烈碰撞以及和西林瓶内壁不断的摩擦，产生大量的热量，体系温度升高，影响药物稳定性。试验中需冷水浴控制温度，同时控制高速搅拌过程中西林瓶的稳定性。

本试验选用微型介质研磨法制备双醋瑞因纳米混悬剂，原辅料消耗少、成本低，方法简便，实验设备易得，研磨效率较高，便于进行纳米混悬剂的处方工艺筛选。应用正交试验设计优化处方工艺参数，制得双醋瑞因纳米混悬剂粒径较小、粒度分布窄，工艺稳定、重现性较好，可用于口服、注射、经皮、黏膜给药等多种给药途径的制剂研究。