针刀干预对膝骨关节炎兔原代软骨细胞活性、凋亡及自噬的影响

修忠标 刘 洪 张良志 刘 晶 林巧璇 卢莉铭 郭泽兴 杨金硕

1.福建中医药大学附属人民医院骨伤一科，福建福州 350004；2.福建中医药大学附属第三人民医院骨伤科，福建福州 350122；3.福建中医药大学中医学院，福建福州 350122；4.福建中医药大学附属康复医院骨伤科，福建福州 350003

中医原创微创技术针刀疗法治疗膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）效果明确，已被多个KOA临床诊疗指南推荐[1-2]，然而其具体作用机制尚不明确。既往研究表明，筋骨失衡引起的异常机械应力可通过调控软骨细胞自噬和凋亡水平参与KOA 软骨退变[3-4]。而针刀可恢复膝周骨骼肌、韧带功能，调整膝关节力学结构，调节筋骨平衡，延缓软骨病理改变[5-7]。针刀治疗KOA 软骨保护作用可能与调节软骨细胞自噬和凋亡水平相关，团队前期已从软骨组织学层面证实，针刀可减少KOA 兔细胞凋亡，改善软骨病理形态[8-9]，本研究将进一步从原代软骨细胞活性、凋亡和自噬等层面来探讨针刀改善KOA 退变的治疗机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

普通健康雄性6 月龄新西兰大白兔24 只，体重（2.5±0.5）kg，购于上海松联实验动物责任有限公司[生产许可证号码：SCXK（沪）2017-0008]，由福建中医药大学实验动物中心[合格证号：SYXK（闽）2019-0007]代购并饲养。单笼喂养，自然光照，自由进食、饮水，室温（23±2）℃。本研究通过福建中医药大学实验动物伦理委员会批准（批件号：FJTCMIACUC），整个实验过程中对动物的各种处理均遵照科技部颁布的《关于善待实验动物的指导意见》有关动物的使用及伦理学规定。

1.2 实验试剂与主要仪器

戊巴比妥钠（上海上药新亚有限公司，生产批号：811B025）；胰蛋白酶（德国Biofroxx 1004GR100）、DMEM 高糖培养基（美国HyClone D6429）；胎牛血清（澳大利亚Gibco 10099）；4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司，货号：P1110）；双抗（上海碧云天生物技术有限公司，货号：SV30010）；CCK-8 法细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0038）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术有效公司，货号：KGA108）；anti-LC3B 抗体（广州徕智生物科技有限公司，货号：bs-2912R）。一次性使用0.4 mm×40 mm 无菌小针刀（江西老宗医医疗器械有限公司，批号：20172270270）；AX002 型高分子石膏（陕西安信医学技术开发有限公司）；KL-T1 型自动脱水机（湖北康龙电子科技有限责任公司）；BMJ-A 型组织包埋机（常州中威电子仪器）；RM2235 型石蜡切片机（德国Leica 公司）；YT-CJ-2NB 型超净工作台（北京亚泰隆）；DH-160 型二氧化碳培养箱（上海三藤仪器Ⅰ）；DSZ2000X 型倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器）；SL02 型低速离心机（知信仪器）；RAD SPEED型数字化拍片系统（日本岛津DR 机）；NIB900-FL 型倒置荧光显微镜（河南兄弟仪器设备有限公司）；离心机（Labofuge 400R）；CytoFLEX 型流式细胞仪（贝克曼库尔特公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与造模 适应性饲养1 周后，按体重进行编号，并应用随机数字表法将其分为空白组、模型组、针刀组，每组8 只。模型组、针刀组采用本团队前期研究的改良Videman 法[13]固定，左后肢膝关节伸直中立位0°放置石膏托，使用高分子石膏绷带、防啃咬绷带环绕，使膝关节固定于伸直中立位0°，踝关节背曲60°塑形，固定6 周[9]。空白组不予处理。

1.3.2 干预 造模成功后，根据《中国经筋学》中关于膝关节经筋病变规律及整合相关文献分析[10-12]，选取常见病灶点“鹤顶次（股四头肌肌腱髌骨上缘附着处）”“髌内下（髌内侧支持带髌骨内下缘附着处）”“髌外下（髌外侧支持带髌骨外下缘附着处）”“成腓间（外侧关节间隙中膝外侧副韧带处）”“委阳次（股二头肌内侧缘）”“阴陵次（鹅足腱胫骨内侧止点处）”，常规消毒铺巾，采用一次性无菌小针刀干预，垂直治疗点皮肤进针直至抵达病变处，松解范围应＜0.5 cm。干预周期为1 个月，每周干预1 次。其余两组不予特殊处理。通过X 线检测对造模兔进行模型评价，结果显示关节间隙变窄、周围骨赘形成表明造模成功[13]。见图1。

1.3.3 原代软骨细胞提取和鉴定 干预结束1 周后，对各组8 只新西兰兔进行原代软骨细胞提取和鉴定，分别腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液（1.5 ml/kg）麻醉后空气栓塞法处死，无菌条件下迅速解剖截取膝关节，然后超净工作台上用刀片刮切软骨至细小碎块，转移至50 ml离心管中，加入5 ml 0.02%Ⅱ型胶原酶、5 ml DMEM培养基，放置CO2培养箱培养4 h；然后通过筛网过滤收集细胞，离心半径11.5 cm、1000 r/min 离心5 min，吸去上清，加入2.5 ml 含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养基，吹打均匀后接种于细胞培养皿，倒置显微镜观察细胞形态。然后采用Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光细胞染色进行软骨细胞鉴定，Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞染色可见软骨细胞胞核清晰，呈蓝色[14]。见图2。

1.3.4 CCK-8 检测细胞活性 96 孔板加入空白组、模型组、针刀组原代软骨细胞100 μl/孔，向各孔中加入10 μl CCK-8 检测溶液，分别在37℃下孵育1、2、4、6、8、12 h，酶标仪在450 nm 波长处检测每孔的吸光度。以培养时间为横轴，吸光度值为纵轴，绘制生长曲线。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI 双染流式检测细胞凋亡用PBS 分别洗涤空白组、模型组、针刀组原代软骨细胞二次，离心半径11.5 cm、1000 r/min 离心5 min，收集细胞，加入500 μl 的Binding Buffer 悬浮细胞；加入5 μl Annexin V-FITC 混匀后，加入5 μl Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应10 min；然后进行流式细胞仪的观察和检测。应用FACSdiva 软件获取10000 个细胞，并进行结果分析，以Annexin V-FITC为横坐标、PI 为纵坐标作图。每组实验重复3 次。

1.3.6 LC3B 免疫荧光染色检测细胞自噬水平 分别制作空白组、模型组、针刀组的细胞爬片，PBS 清洗3 次，用4%多聚甲醛固定30 min；PBS 冲洗，加入0.3%曲拉通37℃通透30 min；PBS 冲洗；5% BSA 37℃封闭60 min；PBS 冲洗，滴加1∶100 的一抗LC3B，4℃过夜；PBS 冲洗，滴加50 μl 抗-LC3B-IgG 标记荧光二抗（1∶500），37℃孵育90 min；PBS 冲洗，DAPI 工作液37℃染核10 min；PBS 冲洗，缓冲甘油封片，在倒置荧光显微镜下观察。每组实验重复3 次，凋亡率取平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组实验兔情况

实验期间三组实验兔状态良好，体重与进食量基本一致，无死亡。

2.2 三组兔原代软骨细胞CCK-8 细胞活性检测比较

三组组内各时间点细胞活性比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；模型组同期细胞活性低于空白组，针刀组同期细胞活性高于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

2.3 三组兔原代软骨细胞Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞凋亡检测比较

模型组软骨细胞凋亡率高于空白组（P ＜0.05），针刀组软骨细胞凋亡率低于模型组（P ＜0.05）。见图4、表1。

表1 三组Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞凋亡率比较

2.4 三组兔原代软骨细胞LC3B 免疫荧光染色细胞自噬水平检测比较

与空白组比较，模型组LC3B 荧光强度下降。与模型组比较，针刀组LC3B 荧光强度增强。见图5。

3 讨论

KOA 被认为是以关节软骨退行性变、骨赘形成、软骨下骨增厚、滑膜炎症、半月板损伤等为特征的慢性退行性疾患。现代医学研究认为筋骨失衡导致的异常机械应力可诱导KOA 软骨退变。自噬在机械压力、缺氧、内质网应激等异常生理条件下对软骨细胞起保护作用，在调节能量和营养、维持体内能量代谢方面起着至关重要的作用，可通过溶酶体对受损或老化的细胞器进行降解和再利用，提供氨基酸、核苷酸、糖类和脂肪酸来维持组织稳态[15]，与软骨细胞的生长、增殖和凋亡等过程密切相关，参与了KOA 重要病理过程[16]。因此，纠正关节软骨表面异常机械应力分布和改善软骨免疫微环境治疗KOA 有效途径[17-18]。

中医多从“筋骨”角度来认识KOA，《素问·痿论》曰：“宗筋主束骨而利机关也。”足三阳经筋和足三阴经筋环绕膝周，各经筋之间相互协调，从而保证关节屈伸功能。KOA 的发病与经筋失衡（骨骼肌、韧带损伤和神经支配功能障碍），筋骨力学结构改变，继而软骨退变密切相关[19]。团队前期梳理经筋理论，研究表明“横络痹阻、筋骨失衡、气血失和”是KOA 关键病机，通过针刀松解膝周经筋病灶点“解结横络”，以“调衡筋骨、调和气血”，从而有效治疗KOA[20]。

自噬作为一种高度保守的细胞行为，对于维持体内稳态促进细胞存活具有重要意义[21]。研究表明[22-23]，软骨细胞自噬水平的升高能够有效抑制软骨细胞凋亡。本研究结果显示，针刀治疗能够提高软骨细胞自噬水平，且对于软骨细胞增殖活性起到促进作用，进一步抑制软骨细胞凋亡。软骨细胞凋亡是KOA 膝关节软骨退变机制中的重要一环[24-26]，软骨细胞凋亡受到多种蛋白调控，但其具体机制尚不明确[27-28]。本研究结果显示，针刀治疗能够抑制软骨细胞凋亡，从而发挥对软骨的保护作用。然而，针刀是通过何种途径对软骨细胞自噬和凋亡产生影响，尚需进一步探索和研究。