甜橙TIFY基因家族的鉴定及其在成花诱导中的表达分析

杨 杰，陈 蓉，胡文娟，佟晓楠,2，李兴涛,2

(1.赣南师范大学 生命科学学院，江西赣州 341000；2.国家脐橙工程技术研究中心，江西赣州 341000)

TIFY蛋白是植物特有的转录因子，被称为花序分生组织中表达的锌指蛋白(Zinc-finger protein expressed in inflorescence meristem，ZIM)家族，因其编码高度保守的TIFY氨基酸序列(TIF[F/Y]XG)，所以被命名为TIFY基因家族[1]。现有研究结果表明，TIFY基因家族成员分为TIFY、JAZ、ZML和PPD共4个亚族[1-3]。其中TIFY亚族只包含TIFY结构域；JAZ亚族包含TIFY和Jas结构域；ZML亚族包含TIFY、CCT和ZML结构域；PPD亚族包含TIFY、PPD和一个不完整的Jas结构域[4]。

TIFY基因最早在拟南芥中发现，因其含有TIFY保守结构域并参与花序发育而得到确认[5]。目前，牵牛花[6]、桃[7]和番茄[8]等植物中的TIFY基因已被陆续鉴定出来，并对其调控植物成花相关功能进行了深入研究。Kim等[6]利用转基因技术将牵牛花的PnFL2转入拟南芥后发现，转基因植株较对照更早开花；Sherif等[7]发现PpJAZ1是桃JA信号通路的一个组成部分，在成花期参与调节花瓣扩张过程；另外过表达SlJAZ2的转基因番茄株侧芽萌发早，花期提前，控制开花时间的基因明显上调，促进植株由营养生长向生殖生长的转变[8]。

甜橙(Citrussinensis)为芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)多年生果树，已逐渐成为中国柑橘产区的主要栽培品种[9-11]。但中国甜橙的品种结构单一，成熟期集中，大量鲜果在短期集中上市，出现季节性卖果困难，降低了果农收益[12]。‘赣南早’是甜橙品种‘纽荷尔’的芽变系，与‘纽荷尔’相比，‘赣南早’花期和熟期分别提前10 d和30 d以上[13]。研究证明，果树提前开花，其果实可提早成熟[14-15]。TIFY转录因子在拟南芥的花序发育和开花中起重要作用[5]，但至今其在甜橙成花诱导过程中的作用机制尚未被报道。本研究基于甜橙基因组数据，采用生物信息学技术对CsTIFYs进行挖掘鉴定，解析该基因家族的蛋白理化性质、染色体定位、结构和进化等信息，并使用qRT-PCR对比分析甜橙不同花期品种成花过程中CsTIFYs的相对表达量，为进一步研究CsTIFYs参与甜橙开花调控中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验甜橙品种‘赣南早’(CitrussinensisOsbeck)和‘纽荷尔’(CitrussinensisOsbeck)由赣南师范大学国家脐橙工程技术研究中心提供，树龄均为8 a生。分别于‘赣南早’开花前120 d(T1)、90 d(T2)、60 d(T3)、30 d(T4)和0 d(T5)采集两甜橙品种短枝新梢(方向朝南)处的花芽和叶片(3个生物学重复)。经液氮速冻后置于 ―80 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 甜橙TIFY基因家族成员鉴定分析 从CPBD(http://citrus.hzau.edu.cn/)下载甜橙基因组数据，使用下载于Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)的TIFY-family模型，通过HMMER软件筛选CsTIFYs。蛋白序列提交CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/term)、InterPro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)和Pfam鉴定TIFY保守结构域，删除不含有该结构域的蛋白，得到的CsTIFYs根据其在染色体的位置依次进行命名。

将所有的甜橙TIFY蛋白序列提交至ExPASy在线工具ProtParam(http：//web.expasy.org/compute_pi/)、ProtComp9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl & group=programs & subgroup=proloc)和SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/nps a_automat.pl?page=npsa_sopma.html)，确定TIFY蛋白序列长度、等电点、亚细胞定位、二级结构等信息；通过Map MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)绘制CsTIFYs在染色体的位置分布图；利用GSDS v2.0(http://gsds.gao-lab.org/)绘制CsTIFYs的内含子-外显子结构图；通过MeMe(http://meme-suite.org/)来注释甜橙中TIFY蛋白保守基序，Motif数量设置为10；基于拟南芥和甜橙的TIFY蛋白序列，使用MEGA 6.0的邻接法构建系统发育进化树，Bootstrap为1 000；从CPBD获取CsTIFYs上游2 kb序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行顺式作用元件的分析；根据CPBD中已发布的甜橙RNA-Seq数据，使用TBtools软件绘制CsTIFYs表达热图。

1.2.2 甜橙TIFY基因家族成员表达分析 取出-80 ℃保存的试验材料，使用新景植物总RNA提取试剂盒(SIMGEN，中国杭州)提取RNA，之后使用反转录试剂盒(SIMGEN，中国杭州)反转录合成cDNA。使用Beacon Designer 7.0软件设计qRT-PCR引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，利用2×SYBR Green PCR Mix(SIMGEN，中国杭州)在罗氏Light-Cycler 480型实时荧光定量PCR仪(Roche，Basel，Switzerland)进行qRT-PCR。反应体系10 μL： 2×SYBR Green PCR Mix 5 μL，正反向引物各 0.5 μL，cDNA(已稀释10倍)和ddH2O各2 μL；反应程序：95 ℃预变性60 s， 95 ℃变性20 s， 60 ℃复性20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。每个样品进行3次技术重复。采用2-△△Ct法[16]计算CsTIFYs相对表达量，使用DPS 9.01数据处理软件对其进行显著性差异分析，利用SigmaPlot 14.0绘制柱形图并注明各组间的差异显著性。

表1 甜橙TIFY基因家族成员定量引物信息Table 1 Quantitative primer sequences of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2 结果与分析

2.1 甜橙TIFY基因家族成员的鉴定和序列 分析

利用甜橙基因组通过HMMER软件筛选及TIFY结构域分析，共鉴定出13个CsTIFYs，依次命名为CsTIFY1～CsTIFY13(表2)。结果表明，甜橙TIFY基因编码的核苷酸长度为363～ 1 122 bp，氨基酸长度为120～373 aa，等电点为4.68～9.49，蛋白质分子质量为13.55～40.63 ku。其中仅有CsTIFY1、CsTIFY6、CsTIFY7、CsTIFY10和CsTIFY12的等电点小于7，为酸性蛋白，其余8个甜橙TIFY基因家族成员均为碱性蛋白。亚细胞定位预测结果显示，绝大多数CsTIFYs定位于细胞核，而CsTIFY4、CsTIFY5、CsTIFY8和CsTIFY11定位于细胞外。

表2 甜橙TIFY基因家族成员基本信息Table 2 Basic information of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2.2 甜橙TIFY蛋白二级结构预测

甜橙TIFY蛋白二级结构预测结果显示(表3)，无规则卷曲是构成甜橙TIFY蛋白结构的重要组成部分，所占比例为50.00%～73.42%；其次是α-螺旋和β-折叠，所占比例分别为 13.06%～34.30%和2.17%～5.49%。

表3 甜橙TIFY蛋白二级结构组成Table 3 Secondary structure composition of TIFY proteins in Citrus sinensis

2.3 甜橙TIFY基因家族成员的染色体定位 分析

13个CsTIFYs不均匀的分布在甜橙8条染色体上(图1)。其中chr1上分布的CsTIFYs最多，有3个；chr2、chr3和chr4上分布的CsTIFYs均为2个；chr5、chr7、chr8和chr9上分布的CsTIFYs最少，各仅有1个。

图1 甜橙TIFY基因家族成员在染色体上的分布Fig.1 Chromosomal distribution of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2.4 甜橙TIFY基因家族成员的结构及保守基序分析

甜橙TIFY基因家族成员的基因结构存在较大差异(图2)。CsTIFYs中内含子的数量为 1～9个，其中CsTIFY6和CsTIFY12均含有9个，数量最多；CsTIFY3含有1个，数量最少；其余CsTIFYs均含2～8个不等。为明确CsTIFYs的进化关系，将13个CsTIFY蛋白序列构建进化树，结果显示在进化树中位置相近的CsTIFYs具有相似的基因结构。

数值表示1 000次重复抽样所得75%以上的置信度

甜橙TIFY蛋白序列含有10个保守的Motif(图3)，位于同一亚族CsTIFY蛋白的Motif数量、类型和分布相似。其中Motif 1、Motif 2和Motif 5存在于所有CsTIFY蛋白上，可能在CsTIFY蛋白功能发挥中起了重要作用；Motif 3仅存在于G亚族，而Motif 6和Motif 10仅存在于C亚族，Motif 7和Motif 9则仅存在于H亚族。

图3 甜橙TIFY基因家族成员的保守基序Fig.3 Conserved motifs of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2.5 甜橙、拟南芥和水稻TIFY基因家族成员的系统进化分析

甜橙(13个)、拟南芥(18)和水稻(20)TIFY蛋白的系统进化分析结果显示(图4)，51个蛋白序列聚类为10亚族(A～J)，甜橙TIFY蛋白分布于B、C、D、E、F、G、H和I亚族中。其中G亚族含有甜橙TIFY蛋白数量最多，为4个；C和H亚族次之，均为2个；其余5个亚族最少，各仅有1个。此外，甜橙TIFY蛋白与拟南芥进化关系较近，与水稻进化关系较远。

分支上数值表示大于75%的自展支持率

2.6 甜橙TIFY基因家族成员启动子的顺式作用元件分析

CsTIFYs上游2 kb序列中顺式作用元件的预测分析结果显示(图5)，CsTIFYs启动子区的顺式作用元件种类及分布具有多样性。其中13个CsTIFYs均包含多个光响应元件和激素响应元件，说明CsTIFYs参与了光调控和激素诱导等过程；CsTIFY7和CsTIFY11包含生理控制响应元件；除CsTIFY1、CsTIFY7、CsTIFY10、和CsTIFY12外，其余9个CsTIFYs均包含数目不一的逆境响应元件，表明CsTIFYs可能在响应非生物胁迫中发挥重要的作用。

图5 甜橙TIFY基因家族成员启动子的顺式作用元件Fig.5 Cis-acting elements within promoter of TIFY gene family members in Citrus sinensis

2.7 甜橙TIFY基因家族成员的组织表达分析

基于甜橙转录组数据对其不同组织中CsTIFYs的表达差异进行分析(图6)。结果表明，13个CsTIFYs在甜橙愈伤组织、花、叶和果实中均有表达，但表达丰度存在明显差异。其中CsTIFY1、CsTIFY5、CsTIFY6、CsTIFY8、CsTIFY11和CsTIFY12在甜橙愈伤组织中优势表达；CsTIFY1、CsTIFY5、CsTIFY8、CsTIFY10和CsTIFY11在甜橙花中高表达；而在甜橙叶中高表达的CsTIFYs仅有3个，分别为CsTIFY5、CsTIFY6和CsTIFY10；此外，除CsTIFY2、CsTIFY7、CsTIFY11、CsTIFY12和CsTIFY13外，其余CsTIFYs均在甜橙果实中优势表达。

2.8 甜橙TIFY基因家族成员的表达特异性 分析

使用qRT-PCR对甜橙花芽(图7)与叶片(图8)中高表达基因CsTIFY1、CsTIFY5、CsTIFY6、CsTIFY8、CsTIFY10和CsTIFY11的时空表达差异进行检测。结果显示，于T1～T5时期中6个CsTIFYs在两甜橙品种的花芽和叶片中均有不同程度的表达。其中各时期CsTIFYs在花芽和叶片中的相对表达量，甜橙早花品种‘赣南早’均高于对照品种‘纽荷尔’。T4和T5时期，除CsTIFY1和CsTIFY6外，其余4个CsTIFYs在两甜橙品种的表达差异较显著。这些结果暗示CsTIFYs可能参与甜橙成花发育和开花时期的调控过程。

图6 甜橙TIFY基因家族成员在其不同组织中的表达模式Fig.6 Expression patterns of TIFY gene family members in different tissues of Citrus sinensis

3 讨 论

基因组测序技术的发展为植物基因家族的鉴定及表达分析提供了有利条件。近年来，已在多种植物中鉴定获得TIFY基因家族成员，这些研究结果揭示植物TIFY基因家族成员在植物生长发育及多种生理生化过程中起重要的调控作用[17-21]。然而，TIFY基因家族成员的数目因物种不同而有所差异[4]。本研究从甜橙基因组中鉴定获得13个TIFY基因家族成员。CsTIFYs外显子数量在2～10个基因结构相对复杂，这与水稻[17]、拟南芥[18]、葡萄[1]、小麦[20]、苹果[19]等植物的研究结果相类似，表明TIFY基因家族成员的基因结构在不同物种中具有保守性。

*表示P<0.05水平上的差异显著性，**表示P<0.01水平上的差异显著性，下同

同一簇的大部分基因通常包含相似的内-外显子结构和基序组成[22]。本研究根据进化关系将13个CsTIFY蛋白划分为8个亚族，聚在同一亚族的大部分CsTIFYs具有相似的内-外显子结构和基序组成；然而，G亚族中CsTIFY1和CsTIFY7的基因结构不同于其余CsTIFYs，推测同一亚族不同基因在进化过程中发生了内含子的丢失或增加。为进一步分析进化关系，构建了CsTIFYs、AtTIFYs和OsTIFYs的系统进化树，结果显示这些成员被划分为10个亚族，其中J亚族只含OsTIFYs，暗示该亚族可能形成于单子叶植物和双子叶植物分化之后；此外，相对于单子叶植物水稻而言，甜橙的进化关系更接近于双子叶植物拟南芥，验证了甜橙和拟南芥这些双子叶植物具有共同祖先[23]。

基因的表达受启动子顺式作用元件的调控[24]。CsTIFYs启动子分析发现大量与激素相关的响应元件，但不同成员之间含有元件的种类和个数均不同，证明CsTIFYs响应激素的种类和程度不同，进而导致CsTIFYs之间功能的差异化。此外，部分CsTIFYs还同时含有多个胁迫响应元件，推测CsTIFYs作为中间转录因子响应不同激素间的调控，从而响应逆境胁迫。为分析CsTIFYs在甜橙生长发育中的作用，本研究对CsTIFYs进行了组织特异性分析，结果显示46%的CsTIFYs在甜橙花和叶片中高表达，表明CsTIFYs在甜橙花芽分化和开花中发挥一定的调控作用。前人研究也发现TIFY基因家族成员对植物花发育有重要作用[7,8,25]，支持了本研究的分析结果。

图8 甜橙 CsTIFYs基因在两甜橙品种叶片中的相对表达量Fig.8 Relative expression of CsTIFYs in leaves

本试验发现花和叶片中高表达CsTIFYs在甜橙不同花期品种的成花过程中存在瞬时表达差异，于T1～T3时期中CsTIFYs的表达水平均呈上升趋势。此外，CsTIFY1等6个基因均在早花品种‘赣南早’中优势表达。这些结果证明CsTIFYs积极参与了甜橙成花诱导过程。这与桃中TIFY基因家族成员在其花诱导和开花过程发挥作用的研究结果相符[7]。本研究全面分析了甜橙TIFY基因家族成员，发现CsTIFYs参与甜橙花、叶片、果实和愈伤组织的发育过程，初步证明了CsTIFYs对甜橙花芽分化和开花的响应，为后续深入开展相关研究提供基础资料。