金花茶番茄红素β-环化酶基因的克隆及表达分析

王 辉， 刘合霞， 周兴文,3， 谭肖玲， 韦晓晓， 李 博*

(1. 信阳农林学院 林学院, 河南 信阳 464000； 2. 玉林师范学院 生物与制药学院, 广西 玉林 537000;3. 福建工程学院 建筑与城乡规划学院, 福建 福州 350118)

0 引言

金花茶(Camellianitidissima)为山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)金花茶组植物，该植物主要分布在广西西南部[1]。金花茶花型优美，花色金黄，是山茶属中较少具有黄色花的类群，具有较高的观赏价值，是我国珍稀的园林观赏植物[2]。类胡萝卜素在植物中广泛存在，具有促进植物花朵及果实颜色形成的作用[3]，ZHOU等[4]研究发现金花茶花瓣中含有新黄质、紫黄质、叶黄素、α-胡萝卜素等多种类胡萝卜素物质；有学者认为类胡萝卜素作为辅助色素促使金花茶花瓣显黄色[5]。植物类胡萝卜素主要通过类胡萝卜素合成途径合成，该合成途径涉及多步酶促反应，其中番茄红素β-环化酶 (Lycopene β-cyclases，LCYb)基因对于催化β-胡萝卜素的形成、调节含β-环的胡萝卜素物质合成、植物果实及花朵颜色的形成具有非常重要的作用[6]。

目前，已从拟南芥[7]、马铃薯[8]、柑橘[9]、枸杞[10]、番茄[11]、欧李[12]、万寿菊[13]、黄秋葵[14]、桃[15]、鸡爪槭[16]、矮牵牛[17]等植物中克隆获得了LCYb基因，并且通过荧光定量PCR对LCYb基因在这些植物不同组织中的表达情况进行了定量研究。LCYb基因可调控萜类物质合成，提高植物对非生物胁迫的抗性[18]。此外LCYb基因还可以调节类胡萝卜素含量的积累，使番茄的果实[19]、西瓜[20]的果瓤、桂花[21](Osmanthusfragrans)的花朵、洋桔梗[22](Eustomagrandiflorum)的花瓣呈现不同的颜色。然而，金花茶LCYb基因的克隆鉴定，以及LCYb基因在金花茶中的表达情况尚未见报道，本研究以金花茶花瓣作为研究材料，利用同源克隆和RACE技术克隆了金花茶LCYb基因的全长序列，对LCYb基因序列进行生物信息学分析，并在转录水平及蛋白水平上研究了LCYb基因在金花茶开花过程中的表达模式，为阐明LCYb基因在金花茶花瓣中类胡萝卜素的合成调控机制，以及调控花瓣显黄色的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采样的金花茶植株栽植于玉林师范学院苗圃。采集金花茶不同开花时期的花瓣，擦洗干净后，放入液氮中进行速冻处理，随后保存于-70 ℃超低温冰箱中。

1.2 实验方法

1.2.1 金花茶花瓣总RNA的提取及CnLCYb基因的克隆

首先利用天泽基因公司生产的RNA提取试剂盒(RN38-EASYspin Plus)提取金花茶花瓣的总RNA，随后对金花茶总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，再利用反转录试剂盒(Fermentas)对总RNA进行反转录，从而获得 cDNA模板。根据genbank已公布植物LCYb基因的保守序列，用 Primer 5.0 软件设计简并引物(表1)，并利用该对引物对金花茶LCYb基因进行PCR扩增，PCR反应程序如下：94 ℃条件下预变性，5 min；94 ℃变性，30 s；56 ℃退火，30 s；68 ℃延伸，50 s；共30个循环；最后68 ℃条件下，延伸5 min。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增获得的产物，随后回收目的片段(Axygen公司)，将目的片段连接在pGEM-Teasy Vector载体上(Promega公司)，再转化到大肠杆菌(E.coli DH5α, TaKaRa公司)，大肠杆菌在添加了氨苄西林(100 g/L)的培养基上进行培养，利用蓝白斑筛选转化子，通过PCR鉴定阳性克隆，摇菌后将样品送至华大基因生物公司进行测序。根据测序所得CnLCYb基因的保守序列，设计了金花茶LCYb基因的5’末端RACE引物LSP5’和3’末端RACE引物LSP3’，随后使用RACE试剂盒克隆CnLCYb基因的3’末端、5’末端，连接pGEM-Teasy载体后寄送给华大基因生物公司进行基因测序。对金花茶LCYb基因的3’末端序列、5’末端序列以及保守片段进行拼接，主要参考周兴文等的方法[4]，然后根据拼接完成的LCYb基因全长序列设计全长扩增引物(表1)，将全长扩增产物与载体进行连接，送至华大基因公司测序，从而获得金花茶LCYb基因。

表1 金花茶 CnLCYb 基因克隆及载体构建所用引物Tab. 1 Primers used in the cloning and expression vector construction of CnLCYb

1.2.2CnLCYb基因的生物信息学分析

首先，使用ORF Finder(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)预测金花茶CnLCYb基因的开放阅读框；随后利用ExPASy在线网站预测金花茶CnLCYb基因的蛋白质性质；通过NCBI网站的blastp程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blastp)进行同源性比对，获取金花茶CnLCYb的同源基因；而LCYb蛋白亚细胞定位及二级结构预测则通过Predict protein(https://www.pridecitprotein.org)在线网站完成；再利用SWISS-MODEL在线网站(https://swissmodel.expasy.org/interactive)对金花茶LCYb蛋白的三级结构模型进行预测。利用MEGA 10软件，采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统进化树，分析LCYb同源基因的系统进化关系(Bootstrap=1 000)。

1.2.3CnLCYb的定量分析

利用Primer 5软件设计CnLCYb基因的荧光定量PCR引物(表1)；利用18 S rRNA作为内参基因进行荧光定量PCR反应，检测LCYb基因在不同开花时期花瓣中的表达情况，每个样品重复3次，采用 2-ΔΔCT法计算差异基因的相对表达量。金花茶的开花过程被划分为幼蕾期(A)、初蕾期(B)、显色期(C)、半开期(D)、盛开期(E)等5个阶段，具体的划分标准参考周兴文等的研究[4]。

2 结果与分析

2.1 金花茶CnLCYb基因的克隆与序列分析

通过简并引物对(JBS1/JBA2)，从金花茶花瓣的cDNA中扩增获得长度约为700 bp的同源片段，随后利用5’RACE引物(LSP5’)扩增获得5’末端序列，利用3’RACE引物(LSP3’)扩增获得3’末端序列，其长度分别为1 200 bp，1 000 bp；接着利用全长扩增引物对CZS1/CZA2进行PCR扩增，得到了长度为1 574 bp的全长序列(图1)。

通过序列比对，发现该基因的全长序列与电子拼接的结果相同，ORF Finder分析表明它的开放阅读框长度为1 515 bp(见图2)，共编码504个氨基酸。

注: M.DNA Marker DL2000; A.CnLCYb保守区扩增产物; B.5’ RACE扩增产物; C.3’ RACE扩增产物; D.CnLCYb全长扩增产物

图2 金花茶CnLCYb基因序列Fig. 2 Sequence of CnLCYb gene in Camellia nitidissima

2.2 金花茶CnLCYb编码蛋白的特征分析

ExPASy分析结果显示，CnLCYb蛋白含有影响蛋白质酸碱性的氨基酸共116个，其中呈酸性的氨基酸有58个，主要由谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)组成，而呈碱性的氨基酸共有58个，则主要由赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)组成。CnLCYb蛋白的不稳定系数值为40.71，属于不稳定蛋白；另外，还发现该蛋白的亲水指数为-0.153，具有亲水性，而脂溶指数则为92.80。通过PSORT Prediction 在线网站对CnLCYb蛋白进行亚细胞定位预测，发现CnLCYb定位在叶绿体上的可能性较大。Predict Protein在线网站预测结果显示，CnLCYb蛋白的二级结构域中无规则卷曲元件所占比例最多，约为42.86%；其次是α-螺旋元件，所占比例为37.1%；而β-折叠元件所占比例最低，只有4.96%，这与利用SWISS-MODEL对金花茶CnLCYb蛋白进行三级结构预测的结果基本相符(图3)。

2.3 金花茶CnLCYb基因编码蛋白质的同源性比对及系统进化分析

在线分析表明，CnLCYb蛋白具有PLN02463(Accession:PLN02463)、Carotene-cycl(Accession:TIGR01790)、Lycopene_cycl(Accession:pfam05834)等保守结构域，其中PLN02463结构域的编码氨基酸起止为60～504位，Carotene-cycl结构域为89～484位，Lycopene_cycl则为89～484位，这些结构域分别属于NADB_Rossmann、Carotene-cycl、Lycopene_cycl超基因家族(图4)，表明金花茶CnLCYb蛋白具有植物LCYb典型的保守区域。

图4 金花茶CnLCYb蛋白功能结构域预测Fig. 4 Prediting functional domain of CnLCYb protein in Camellia nitidissima

为解析金花茶CnLCYb蛋白与其他植物LCYb蛋白的系统进化关系，通过NCBI数据库搜寻，获得了17条与金花茶CnLCYb蛋白相似性较高的氨基酸序列(Identity>85%)，随后利用这些氨基酸序列与金花茶CnLCYb蛋白序列构建系统进化树(图5)，结果显示金花茶CnLCYb蛋白与同为山茶科山茶属的茶树LCYb蛋白的亲缘关系最近，在系统进化树中它们被聚类于一个小分支内；另外还发现金花茶CnLCYb蛋白与杂交杜鹃(Rhododendronkiusianum×Rhododendron indicum)、猕猴桃(Actinidiarufa)、柿子(Diospyroskaki)、油橄榄(Oleaeuropaeavar.sylvestris)等植物的LCYb也具有较高的相似性，而与雷公藤(Tripterygiumwilfordii)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、麻风树(Jatrophacurcas)、木薯(Manihotesculenta)、毛果杨(Populustrichocarpa)的亲缘关系最远。

图5 金花茶CnLCYb基因系统发生树Fig. 5 Phylogenetic tree of CnLCYb gene in Camellia nitidissima

2.4 金花茶CnLCYb基因开花过程中的表达分析

通过对金花茶CnLCYb基因的荧光定量PCR分析，发现在金花茶开花的早期和中期，即从幼蕾期到显色期，CnLCYb基因的表达量相对较低，CnLCYb基因主要在花朵开放的后期(即半开期和盛开期)表达量较高(见图6)，研究结果表明在金花茶花朵开放进程中，CnLCYb基因在花瓣中的表达总体呈现上升的趋势，并在花朵盛开期达到最大值。

注:A.幼蕾期; B.初蕾期; C.显色期; D.半开期;E.盛开期

3 讨论

植物中LCYb基因是一个大家族，不同类别植物的LCYb蛋白的氨基酸序列差异较大(Ronen et al., 1999)，它们序列长度主要处于1 650～1 900 bp之间，编码序列长度范围约为495～505个氨基酸，本研究中克隆获得的金花茶CnLCYb基因全长序列为1 515 bp，编码504个氨基酸，且该基因含有植物番茄红素β-环化酶中特有的保守基序[23-24]，如LCYb conserved regions、a dinucleotide FAD/NAD-binding domain(DX4GXGXAX4A)、Cyclase motif I、Cyclase motif II以及带电区域(A charged region)；另外，在系统进化分析中发现金花茶CnLCYb基因与同为山茶属的茶树LCYb基因的相似性最高，上述结果表明本研究的克隆分析结果客观可信。

花是被子植物的基本特征之一，是有性生殖不可缺少的器官，其中花色在吸引传粉者方面具有重要的作用[25,26]，而花色与植物所含色素有关，花色素主要包括类胡萝卜素、花青素和甜菜素等3种[27]。 类胡萝卜素是C40萜类化合物，广泛存在于植物的质体中，在光合作用、光损伤保护、激素合成中发挥重要的作用，也是花和水果中最重要的色素之一[28-29]。金花茶花瓣中含有新黄质、紫黄质、叶黄素、α-胡萝卜素等多种类胡萝卜素[4]，这些化合物可能作为辅助色素调控金花茶的花色。LCYb基因对于调节类胡萝卜素合成具有重要作用，但LCYb基因在不同花色的植物中的表达模式存在差异。例如，在栽培番茄(Solanumlycopersicum)、万寿菊(Tageteserecta)品种‘V-01M’中，虽然栽培番茄的花色为橙黄色，万寿菊品种‘V-01M’的花色呈黄色，但它们的LCYb基因表达模式和金花茶CnLCYb基因的表达模式类似，都表现为开花早期及中期LCYb基因中度表达，在花朵完全盛开之后表达量则有所提高，LCYb基因表达量呈现后期升高趋势[30-31]。然而，在野生番茄(Solanumchilense)、黄杜鹃(Rhododendronmolle)、万寿菊、水仙(Narcissuspseudonarcissus)等花朵呈黄色的植物中，LCYb基因在开花过程中的表达量逐步增高，但随着花朵的完全开放，该基因的表达量则有所下降，LCYb的表达量表现为先升高后降低的趋势[31-33]，这些植物中LCYb基因的表达模式与金花茶存在明显不同。另外，还发现在花色呈白色的万寿菊品种‘snowdrift’中，LCYb基因为中低度表达，在该植物的整个开花过程中LCYb基因不存在表达量的变化[34]。综上所述，对LCYb基因在多种不同花色植物中的表达情况进行比较，发现在同为开黄色花的金花茶和万寿菊品种‘V-01M’中LCYb基因具有类似的表达模式，因此，推测在调控花色的作用机制中这两种植物的LCYb基因具有相同功能，但具体的分子作用机制仍有待验证。

4 结论

利用同源克隆和RACE技术克隆得到了金花茶CnLCYb基因的全长序列，该基因开发阅读框全长1 515 bp，共编码504个氨基酸。荧光定量PCR分析表明，金花茶CnLCYb基因在花发育过程中表现出先降低后升高的趋势，在盛花期表达量最高。本研究为后续深入研究CnLCYb基因功能提供了可操作基因，为深入研究CnLCYb基因调控金花茶花色的作用机理提供了一定的理论基础。