抗生素早期慢暴露对大鼠成年后肠-脑轴的影响

张 准， 张亚文， 刘印明， 田建英

（宁夏医科大学基础医学院，银川 750004）

哺乳动物肠道含有大量的菌群，在营养、代谢、抵御病原体和免疫系统的发育方面发挥着重要作用。肠道微生物群的定植影响哺乳动物的大脑发育和成年后的神经行为。认知功能也受肠道菌群动态变化的影响[1]。在无菌小鼠体内，突触素和PSD-95 表达水平变化，神经兴奋性改变，焦虑行为异常[2]。在慢性应激状态下，无菌小鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-a-drenal axis，HPA）失衡，神经内分泌活动异常[3]，大脑海马区脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）表达改变[4]。由于胃肠系统的物质运输特征，肠道细菌群对抗生素特别敏感[5]。抗生素可以改变肠道群落，即使浓度远低于致死剂量[6]。

目前，畜禽养殖场使用抗生素十分普遍[7]，抗生素环境残留已经成为威肋人类健康和生态环境安全的重要公共卫生问题。地表水和沉积物中可检出喹诺酮类（QNs）、大环内酯类（MLs）和四环素类（TCs）抗生素；耕地土壤中检测到QNs 和TCs；鱼类和蔬菜植物中检出了QNs[8]。动物源性食物中也残留抗生素。人们通过进食和饮用水，不可避免地长期暴露于环境抗生素，导致肠道菌群失调，危害人体健康。研究[9]证实，肠道菌群失调与精神障碍的发生有关。抗生素是否会对肠-脑轴、海马发育产生影响，目前尚不清楚。本研究拟观察大鼠生命早期慢性暴露于环境中普遍存留的抗生素，对其成年后肠道菌群结构、海马形态和功能的影响，以探讨抗生素对肠-脑轴的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与分组

Morris 水迷宫、Water Maze 处理软件（北京硕林苑科技有限公司），RM2235 石蜡切片机（德国Leica 公司），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6 及IL-1β ELISA 检测试剂盒（中国万类生物公司）。

选取16 只出生后第21 天（PND21）、体质量50～55 g 的SD 雄性大鼠，由宁夏医科大学实验动物中心提供（批号：10752309201900100）。随机分为对照组（Con）和抗生素组（Abx）。Con 组大鼠一直饮用无菌水；Abx 组大鼠依次在无菌水中添加盐酸四环素（3 周，2 g·L-1）、罗红霉素（1 周，0.005 g·L-1）和盐酸环丙沙星（6 周，0.1 g·L-1）。10 周后，收集大鼠粪便，-80℃保存，行Morris 水迷宫行为测试。结束后，对大鼠进行麻醉，取血清，-80℃保存，取大鼠脑组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，并进行HE 染色。

1.2 实验方法

1.2.1 Morris 水迷宫实验 对大鼠进行定位航行实验，前4 d 进行水迷宫学习训练；第5 天观察其空间记忆能力；第6 天行空间探索实验，观察大鼠对空间位置记忆的保持能力。评价指标：逃逸潜伏期、穿越原平台次数。

1.2.2 16SrDNA 测序技术 粪菌样本经蛋白酶K 酶解、离心、HiBind 柱子洗脱，提取DNA。对提取的DNA 的16SrDNA V3-V4 区进行PCR 扩增，序列测定。细菌16SrDNA V3-V4 区域通用引物：341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。经数据拆分、数据拼接和过滤、DADA2 去噪后，对菌群多样性进行生物信息分析。

1.2.3 ELISA 法检测血清炎性因子水平 具体步骤均按照ELISA 试剂盒说明书操作。

1.2.4 海马组织HE 染色 行为学实验结束后，对大鼠10%水合氯醛麻醉，开胸暴露心脏，于左心尖处刺入灌流针，剪开右心耳，PBS 缓冲液灌流冲洗干净后，4%多聚甲醛灌流固定，取脑，置于4%多聚甲醛中过夜。取大鼠海马区脑组织石蜡包埋，冠状切片，厚度5 μm，HE 染色，放置光镜下观察。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 23.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。若两组数据符合正态分布且方差齐，组间比较采用两独立样本比较的t 检验；若两组数据中，有一组数据不符合正态分布或两组数据方差不齐，组间比较采用Mann-whitney U 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫实验观察

第10 周后，Abx 组大鼠逃逸潜伏期较对照组延长（P＜0.05），见图1。

图1 抗生素早期慢性暴露对大鼠成年后空间记忆能力的影响（n=7）

2.2 肠道菌群分析

2.2.1 Alpha 多样性检测 为评估肠道菌群的群落多样性，进行了Chao1 指数、Shannon 指数和Simpson 指数分析。各样本Chao1 指数、Shannon指数和Simpson 指数的稀释曲线趋于平坦，测序数量饱和（图2）。结果显示，与Con 组相比，Abx组Chao1 指数、Shannon 指数和Simpson 指数均降低（P 均＜0.01），见表1。

图2 Chao1 指数、Shannon 指数和Simpson 指数稀释曲线

表1 两组大鼠肠道菌群的Alpha 多样性比较（n=7）

2.2.2 菌群相对丰度比较 在门水平上，与Con组相比，Abx 组厚壁菌门（Firmicutes）减少，疣微菌门（Verrucomicrobia）增多（P 均＜0.01），见表2、图3；在属水平上，与Con 相比，Abx 组乳杆菌属（Lactobacillus）、Ruminococcaceae_UCG-005 减少，艾克曼菌属（Akkermansia）、拟杆菌属（Bacteroides）增多（P 均＜0.01），见表3、图4；Con 组与Abx 组均有序列划入相同的OUT 中，共有300 个相同的OUT（图5）。

图5 韦恩图

表2 门水平不同菌群（前4 个）的平均相对丰度（%）

图3 门水平不同菌群相对丰度

表3 属水平不同菌群（前5 个）的平均相对丰度（%）

图4 属水平不同菌群相对丰度

2.3 血清炎性因子的变化

与Con 组比较，Abx 组大鼠血清中的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的浓度均升高（P 均＜0.01），见表4。

表4 大鼠血清中炎性因子表达水平的变化（pg·mL-1）

2.4 海马组织形态变化

抗生素暴露10 周后，光镜下显示Con 组大鼠海马组织细胞轮廓清晰、排列整齐；Abx 组大鼠海马组织结构松散，齿状回的闩区神经元结构排列疏松紊乱、可见核固缩，见图6。

图6 抗生素慢性暴露对海马组织形态的影响（n=3）

3 讨论

肠道菌群对人体免疫、内分泌、神经等生理作用的发挥以及许多疾病的发生都有十分重要的作用。抗生素药物的使用不当会引起肠道微生物群落组成的大幅度、持久的改变和疾病的发生。生命早期使用抗生素可能与过敏、肥胖等疾病的发生有关[10]。

抗生素的使用会破坏肠道菌群的平衡。恩诺沙星处理的肠道革兰阳性厚壁菌数量增加，革兰阴性拟杆菌、蛋白质细菌和疣状芽胞杆菌数量减少[11]。混合广谱抗生素处理的新生小鼠肠道菌群多样性指数降低[12]。环丙沙星（Cip）可诱导氧化应激和损害线粒体功能[13]。头孢曲松能改变肠道菌群，补充益生菌、乳酸杆菌可以通过稳定肠道菌群来减轻抗生素的副反应[14]。长期应用广谱抗生素引起拟杆菌增多，能导致内源性感染。本研究发现，盐酸四环素、罗红霉素、盐酸环丙沙星前后依次暴露可致大鼠肠道厚壁菌门、乳杆菌属、Ruminococcaceae_UCG-005 减少，拟杆菌属等条件致病菌增多，Abx 组内各样本间菌群表现出较高的相似性，表明抗生素慢性暴露可导致大鼠肠道菌群多样性的改变，引起肠道微生态失调。

抗生素暴露引起的肠道细菌构成和数量呈时间依赖性，可启动自噬、免疫失调和内脏超敏反应，对神经系统发育具有长远影响[15]。肠道菌群紊乱还可促进神经炎症和神经退行性变[16]。生命初期是神经发生、发育快速期，也是肠道菌群定植、微生态平衡形成的关键时期，肠道菌群在脑疾病发展中的作用应受到重视[17]。

肠道菌群结构改变可引起肠-脑轴功能紊乱，进而影响神经系统发育。缺乏正常菌群的小鼠可表现出焦虑及抑郁样行为增加。无菌小鼠认知功能发育异常[18]。出生21 d 混合抗生素暴露，可影响成年雄性BALB/c 小鼠肠道菌群组成和神经行为[17]。Fröhlich 等[19]发现混合广谱抗生素处理的新生小鼠，肠道菌群多样性指数降低，海马区γ-氨基丁酸A 型受体α1 亚型mRNA 升高，表明生命早期使用抗生素引起的肠道菌群紊乱，能对小鼠的脑部功能发育产生不良影响[12]，也说明肠-脑轴、肠道菌群稳态在生命早期神经发生、发育中发挥不可替代的作用。

环境中存留的盐酸四环素和罗红霉素均不能通过血脑屏障，环丙沙星可降低菌群多样性[5]。基于此，本研究模拟生态模式，使幼鼠依次暴露于环境中普遍存在的盐酸四环素、罗红霉素和盐酸环丙沙星。10 周后，抗生素组Shannon 指数和Simpson 指数均低于对照组，表明菌群群落多样性降低。Desbonnet 等[9]研究发现，抗生素引起肠道菌群多样性及丰富度下降可致小鼠BDNF 表达量降低，是导致其认知障碍的一个重要原因。本研究结果也证实，抗生素组大鼠逃逸潜伏期延长，海马组织结构松散，齿状回的闩区神经元可见核固缩，表明幼年抗生素持续暴露可损害肠-脑轴途径，致成年后的空间记忆能力下降。

植物乳杆菌在肠道内的下降与认知障碍有关。本研究发现，在属水平上，抗生素组乳杆菌属水平降低。Anisimova 等[20]结果显示，90%的乳酸杆菌对克林霉素敏感，95%的菌株对四环素、红霉素和利福平敏感。美金刚联合植物乳杆菌治疗12 周可改善认知功能恶化，降低海马区Aβ 水平，保护神经元的完整性和可塑性[21]。本研究中拟杆菌属等条件致病菌增多，血清中的炎性因子TNFα、IL-6、IL-1β 水平升高，表明肠道菌群失调可影响大脑认知功能，可能与损害肠-脑轴的免疫途径有关。

综上所述，抗生素生命早期暴露对大脑发育及成年后的神经行为产生的重大影响，可能与肠道菌群结构改变、海马神经发生不足有关。