PT2399 通过抑制HIF-2α 对小鼠关节软骨的保护作用

周 永， 冯罡宁， 丁 冬， 胡学宇， 燕江波， 唐志群， 金群华

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院，银川 750004）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是运动系统中较为常见的无菌性炎症，多发生在膝关节[1]。全世界至少有3 亿人患有OA[2]。目前各种治疗手段均无法有效阻止OA 的恶化。OA 涉及多种关节内的组织和细胞，由于其主要病变部位位于软骨，所以软骨一直是OA 研究的重点[3]。关节软骨是一种缺少血管和神经分布的结缔组织[4]，关节软骨细胞长期处于氧缺乏的内环境，其环境氧含量自软骨表面由浅及深逐渐降低[5]。而软骨细胞的氧源于关节液和血管丰富的软骨下骨[6]。

HIF 蛋白属于转录因子家族，是细胞响应缺氧的关键因子。HIF 蛋白由α 和β 亚基两部分组成。HIF 蛋白家族共有3 个成员：HIF-1、HIF-2和HIF-3。HIF 蛋白α 亚基在正常含氧情况下可以被脯氨酰羟化酶羟基化，最终导致了HIF-α降解[7]。在氧含量低的情况下，HIF-α 不易被羟基化，易与β 亚基形成异二聚体后在细胞质中蓄积，进入细胞核，进而激活下游靶向基因而发挥作用[8]。研究[9]表明，缺氧在软骨细胞中起着两方面作用：一方面HIF-1α 对维护关节软骨起着保护作用，其具有促进软骨细胞外基质合成，抑制runx2 和Wnt 的作用。另一方面，在前炎性细胞因子的存在下，HIF-2α 则对软骨细胞外基质具有破坏作用，并会增强VEGF、MMP13 和某些异常胶原的表达。β-连环蛋白（β-catenin）在Wnt 信号通路中是一种关键分子，分布于软骨组织细胞内[10]。β-catenin 信号通路的激活在软骨增生与成长中有不可取代的作用，但其在某些病理情况下被过度激活可能导致软骨退变和OA 形成[11]。PT2399是一种高效的、选择性的HIF-2α 的拮抗剂，能直接结合HIF-2α 的PASB 结构域。透明细胞肾癌是以pVHL 失活为特征的细胞恶性增殖[12-13]，而PT2399 在人透明细胞肾癌细胞中分离了HIF-2α/HIF-1β 形成的异源性二聚体[14]，使得HIF-2α的生物学作用被抑制，因此PT2399 因对HIF-2α产生的拮抗作用而具有高效的体内抗肿瘤活性。然而PT2399 能否通过抑制HIF-2α 来延缓OA的发展尚不清楚。本研究通过对OA 小鼠注射HIF-2α 抑制剂PT2399 来探究HIF-2α 在OA 中的作用，并探究HIF-2α 是否通过β-catenin 对OA 产生作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择30 只雄性C57BL/6 小鼠（购自宁夏医科大学实验动物中心，动物许可证号：IACUC-NYLAC-2020-147），8 周龄（体质量：18～20 g），分为3 组：不进行处理（对照组）、行内侧半月板失稳术（destabilization of the medial meniscus，DMM）造模（模型组）、DMM 建模后PT2399 治疗组（治疗组），每组10 只。小鼠处于22 ℃和（60±5）%的湿度，12 h 光/暗周期环境，可以自由活动并获取食物和水。模型手术部位为小鼠的右膝关节，治疗组小鼠在造模后每天进行腹腔注射PT2399（30 mg/100 g）。

1.2 材料

PT2399 购自美国MCE 公司；组织固定液、磷酸盐缓冲液（PBS）、番红O 固绿液体染色剂、伊红染液、苏木素染液、10%EDTA 脱钙液购自武汉Servicebio 公司；PV-9001 二抗试剂盒购自南京中杉金桥公司；兔源HIF-2α 抗体、β-catenin、Ⅱ型胶原抗体、基质金属蛋白酶13（MMP13）抗体和山羊抗兔IgGH&L 均购自美国Abcam 公司；小量组织全RNA 提取试剂盒购自美国爱思进公司；一步法cDNA 反转录试剂盒、qRT-PCR 试剂盒购自北京全式金公司；抗荧光衰减封片剂购自上海碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 组织处理 治疗8 周后处死3 组小鼠。取右膝关节新鲜标本，将标本置于4%多聚甲醛液中固定，使用PBS 多次冲洗，置于10%EDTA 脱钙液中脱钙，每天换液1 次。成功脱钙后，使用蜡块包埋。将蜡块置于冰台上3～5 min 后将其切成厚度为4 μm 冠状位切片，置于37 ℃水浴，使用载玻片捞片后，于烤片机上（60 ℃）烤干，进行下一步实验。

1.3.2 番红O 固绿和HE 染色观察分析小鼠膝关节软骨组织的病理改变 将组织切片置于60 ℃烤片机中30 min，二甲苯2 次脱蜡，然后在梯度乙醇溶液中进行水化，苏木素染色4 min，0.5%盐酸乙醇溶液分化5 s，返蓝15 min。使用0.3%固绿染色4 min，1%醋酸冲洗5 s，0.15%番红染色4 min，最后使用梯度上升的乙醇溶液脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在HE 染色实验中，将组织切片烘干、脱蜡、苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、冲洗、封片。在400 倍光镜下观察软骨组织的病理变化，采用国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分进行评估，评分越高，表示骨关节炎程度越重。

1.3.3 免疫组织化学（IHC）检测小鼠软骨组织中HIF-2α 和MMP13 的表达情况 HIF-2α 和MMP13的阳性表达为IHC 染色下呈现棕色。将切片脱蜡、水化，胰蛋白酶修复抗原、山羊血清封闭、滴加一抗（4 ℃）反应12 h。所用一抗为Anti-HIF-2α:（1∶200），Anti-β-catenin:（1∶200），Anti-II 型胶原（1∶300）。采用Image J 1.8.0 软件分析3 组小鼠软骨层中相应蛋白的阳性细胞所占软骨面积的百分比。

1.3.4 免疫荧光（IF）检测小鼠软骨组织中β-catenin和Ⅱ型胶原蛋白的表达情况 β-catenin 和Ⅱ型胶原阳性表达为IF 下呈红色。将切片脱蜡，水化，胰酶抗原修复，山羊血清封闭、滴加一抗（4 ℃）反应12 h。随后与山羊抗兔二抗（1∶300，37 ℃）反应1 h。使用倒置荧光显微镜进行观察并及时拍照。使用Image Pro Plus 6.0 软件选取小鼠软骨区域，分别计量不同组别相应蛋白的阳性细胞平均吸光度（IOD），使用GraphPad Prism 8.3.0统计学软件分析数据。

1.3.5 qRT-PCR 实验检测不同分组小鼠软骨中HIF-2α 和β-catenin 的mRNA 表达变化 使用组织RNA 提取试剂盒提取小鼠关节软骨中总RNA，然后进行实时定量PCR 反应。使用2-△△CT计算目的基因相对表达量。所用qRT-PCR 引物序列见表1。

表1 所用qRT-PCR 引物序列

1.4 统计学方法

数据采用GraphPad Prism 8.3.0 统计学软件进行分析，本研究数据满足方差齐性要求，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠软骨退变比较

番红O 固绿和HE 染色结果显示：相对于治疗组，模型组小鼠的软骨组织丢失较多，软骨层变薄磨损较重；治疗组小鼠可见部分软骨丢失，软骨组织较模型组厚，见图1。

图1 小鼠膝关节软骨组织病理改变（×400）

透明软骨厚度：对照组>治疗组>模型组，钙化软骨厚度和OARSI 评分：对照组<治疗组<模型组（P 均＜0.01），见表2。

表2 各组小鼠软骨组织退变比较（±s）

表2 各组小鼠软骨组织退变比较（±s）

OARSI评分/分对照组 84.96±3.92 19.13±1.54 0.44±0.35模型组 19.10±22.03* 85.03±3.01* 5.61±0.49*治疗组 47.33±25.91*# 46.81±1.99*# 2.80±0.71*#F 值 98.32 106.79 188.32 P 值 <0.01 <0.01 <0.01组别 透明软骨厚度/μm钙化软骨厚度/μm

2.2 各组小鼠软骨组织中HIF-2α、MMP13、βcatenin 和Ⅱ型胶原相对表达情况

IHC 结果显示：模型组HIF-2α 和MMP13 表达量高于治疗组和对照组，治疗组高于对照组（P均＜0.01），见图2、表3。

图2 小鼠膝关节软骨HIF-2α、MMP13 的表达情况（IHC×400）

表3 各组小鼠膝关节软骨HIF-2α、MMP13 的阳性表达率比较（%）

IF 结果显示：模型组小鼠β-catenin 蛋白相对表达高于治疗组和对照组，治疗组高于对照组（P 均＜0.01）；模型组小鼠软骨组织中Ⅱ型胶原相对表达低于治疗组和对照组，治疗组低于对照组（P 均＜0.01），见图3、图4。

图3 小鼠膝关节软骨β-catenin 和Ⅱ型胶原的表达情况（IF×400）

图4 各组小鼠膝关节软骨β-catenin 和Ⅱ型胶原的IOD 值

2.3 各组小鼠HIF-2α 和β-catenin 的mRNA 的表达情况

qRT-PCR 实验结果可见，小鼠软骨组织中HIF-2α 和β-catenin 的mRNA 表达量：对照组<治疗组<模型组（P 均＜0.05），见图5。

图5 各组小鼠软骨组织中HIF-2α 和β-catenin 的mRNA 相对表达情况

3 讨论

本研究结果可见，在OA 的发展过程中，软骨细胞坏死丢失，表面被破坏，透明软骨因磨损变薄而逐渐消失，模型组标本可见钙化软骨厚度增加，OARSI 评分升高。IHC 结果显示，软骨破坏后，HIF-2α 蛋白的表达增加，提示其表达与OA的发生、发展有关。另外，通过造模和注射PT2399引发HIF-2α 表达变化时，HIF-2α 与β-catenin表达趋势相同，qRT-PCR 实验结果也证实了这一点，表明HIF-2α 可能对Wnt 通路具有调节作用。

Ⅱ型胶原是软骨细胞外基质的重要组成部分，对软骨细胞起物理支持、营养和保护作用[15]。在本实验中，可见Ⅱ型胶原的表达随软骨破坏的增加而逐渐减少。MMP13 是软骨Ⅱ型胶原的主要降解酶，在OA 中发挥重要作用[15]。HIF-2α 和MMP13 的蛋白表达可随软骨破坏程度的增加而增加，提示在发生OA 时，HIF-2α 对MMP13存在诱导和协同作用[16-17]。

HIF-2α 定位于高分化软骨细胞中，是调节低氧环境下软骨分解代谢的重要因子[18]。随着小鼠和人的骨关节炎软骨组织内HIF-2α 表达的含量增高，软骨细胞的凋亡作用也呈增加的趋势[7]。HIF-2α 诱导软骨细胞凋亡是通过其对Fas基因来调控的。Fas 基因通过下游凋亡相关因子而引发软骨细胞凋亡，最终造成关节软骨细胞的丢失与破坏[19]。另外，HIF-2α 能抑制软骨细胞中的自噬，与软骨破坏过程呈正相关[20]。

PT2399 可通过结合HIF-2α 的PASB 结构域，改变其分子结构，进而达到干扰或抑制HIF-2α 的表达作用。在肾透明细胞癌中，pVHL 下调导致肾癌细胞恶性增殖，PT2399 在人肾透明细胞癌中分离了HIF-2α/HIF-1β 形成的异源性二聚体，这使得HIF-2α 的生物学作用被抑制，因此PT2399 对HIF-2α 产生了拮抗作用。

本研究将HIF-2α 抑制剂PT2399 应用于小鼠OA 中，发现PT2399 具有延缓OA 发展的作用，这种用于治疗肾癌的新型药剂也许是治疗OA及其相关研究的新方向。