XAD-7HP树脂纯化款冬花多糖工艺研究*

韩毅丽，张 澍，裴晓丽

(山西中医药大学中药与食品工程学院，山西 晋中 030619)

款冬花(Farfarae Flos)为菊科(Compositae)款冬属植物款冬(Tussilago farfara L.)的干燥花蕾，性辛温，味微苦，归肺经。主要产自陕西、山西、河南、甘肃等地。具有润肺下气、止咳化痰等功效，主要活性成分为黄酮类、萜类、多糖类、生物碱类，其中多糖类还具有抗肿瘤等活性，是研究的主要活性成分之一，并且多糖的纯度不同，其活性不同，因此款冬花中多糖的纯化，对于款冬花多糖的研究具有重要的实际意义[1-2]。目前，款冬花多糖的主要纯化方法有盐酸法、三氯乙酸法、SEVAGE法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶结合SEVAGE法、活性炭法、双氧水法、反胶束溶液法、大孔树脂法等，纯化效果较好的为木瓜蛋白酶结合SEVAGE法和大孔吸附树脂法，且多糖纯化常用大孔吸附树脂多为S-8型、D-101型、AB-8型、LS-206型、HPD-100型、XAD-16型等树脂，XAD-7HP型树脂的纯化工艺未见报道[2-8]。本论文采用单因素法考察了弱极性XAD-7HP型大孔吸附树脂纯化款冬花多糖的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

款冬花药材(批号：200101),山西元和堂中药有限公司；XAD-7HP吸附树脂,山西慧德易科技有限责任公司；蒸馏水(生产批号：201902237103SJ),山西娃哈哈昌盛饮料有限公司；无水乙醇、苯酚、浓硫酸、氯仿、正丁醇、氢氧化钠、盐酸,均为分析纯,天津市北辰方正试剂厂；紫外-可见分光光度计(TU-1810),北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 款冬花粗多糖的制备

将款冬花粉碎，采用95%乙醇为提取剂，按1:10 (g:V)的料液比，回流脱脂2次，每次2 h，过滤，挥干乙醇备用[3]。

精密称取脱脂后的款冬花药材20 g，加入圆底烧瓶，按照1:20的料液比，加入蒸馏水400毫升，80 ℃加热回流1 h，过滤，再向圆底烧瓶中加入400 mL的蒸馏水，80 ℃加热回流 1 h，过滤，合并滤液，90 ℃浓缩至30 mL，采用Sevage试剂(氯仿:正丁醇为4:1)[4]除蛋白，直至不再有白色沉淀出现。将脱蛋白后的款冬花粗多糖提取液，加入三倍体积的无水乙醇，静置过夜后抽虑。挥干溶剂，即得粗多糖。

1.2.2 多糖的含量测定

(1)对照品溶液的制备

精密称取D-无水葡萄糖对照品14.1 mg放入小烧杯，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶，摇匀，得浓度为0.141 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

(2)测定波长的选择

精密移取上述对照品溶液0.0、0.5 mL，分别置于10 mL比色管中，加蒸馏水至2.0 mL，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，放置2 min，摇匀，沸水浴显色20 min，冷却至室温。以相应试剂为空白，在波长为400～600 nm进行扫描，得最大吸收波长为490 nm，结果见图1。

图1 葡萄糖对照吸收光谱曲线图Fig.1 Curve of absorption spectrum of glucose reference substance

(3)标准曲线的绘制

精密移取对照品溶液0.00、0.25、0.30、0.35、0.45、0.60、0.70 mL于10 mL比色管中，按“(2)”项下方法显色，490 nm处测定吸光度值，结果在0.0044 ～ 0.0123 mg/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程：A=49.37C+0.0015，线性相关系数为r=0.9999，结果见图2。

图2 葡萄糖对照标准曲线Fig.2 Standard curve of glucose reference substance

(4)样品含量的测定

精密称取款冬花多糖0.5000 g，定容至100 mL容量瓶，精密移液0.08 mL于10 mL比色管中，按“1.2.2.2”项下方法显色，490 nm处测定吸光度值，根据线性方程计算多糖浓度。

2 款冬花多糖的纯化工艺研究

2.1 大孔树脂预处理

室温下，将XAD-7HP吸附树脂用无水乙醇密封浸泡8 h，用去离子水洗去乙醇，然后用质量分数为5%的NaOH浸泡 8 h，用去离子水洗至中性，再用质量分数为5%的HC1浸泡 8 h，用去离子水洗至中性待用。

2.2 纯化流程

将制备的款冬花粗多糖用蒸馏水配置成一定浓度的溶液，以一定的速度上样至树脂层析柱，再用一定浓度的乙醇以一定的速度洗脱。

式中：C0为提取液中多糖浓度mg/mL；Ce为滤液中多糖浓度mg/mL；Cd为洗脱液中多糖浓度mg/mL；V0为提取液体积mL；Vd为洗脱液体积；M1为提纯样液中的质量；M2为样液烘干后质量。

2.2.1 上样浓度对吸附效果的影响

取5 g经预处理的XAD-7HP型树脂，湿法装柱。将浓度分别是0.9624、0.4812、0.3208、0.2406、0.1926 mg/mL的款冬花多糖提取液5、10、15、20、25 mL以相同的速度上样。测量吸附后款冬花多糖溶液的吸光度，计算吸附率。

2.2.2 上样速度对吸附效果的影响

配制5份相同浓度款冬花多糖提取液，分别以0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL/min的上样速度进行上样。检测吸附后款冬花提取液的吸光度，计算吸附率。

2.2.3 不同洗脱浓度对洗脱效果的影响

当洗脱速度为1.0 mL/min，洗脱液体积是15 mL时，以体积分数分别为55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液进行洗脱，分别计算洗脱液中款冬花多糖的吸光度，计算洗脱率。

2.2.4 不同洗脱速度对洗脱效果的影响

用上述步骤得到的最佳体积分数的洗脱剂进行洗脱，考察洗脱速度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min时，洗脱液中款冬花多糖的吸光度，计算洗脱率。

3 结果与分析

3.1 上样浓度对吸附效果的影响

从图3看到，当上样浓度逐渐增大时，吸附率也跟着上升，当上样浓度超过0.3208 mg/mL时，吸附率开始下降。这是因为上样液浓度较低时有部分XAD-7HP树脂未达到饱和状态，增加多糖溶液的浓度，就增大了多糖分子与XAD-7HP树脂的接触机会，多糖分子就可以扩散进树脂，从而增大了多糖分子被XAD-7HP树脂吸附的机会，但是当多糖的溶液浓度超过某一值时，XAD-7HP树脂表面的多糖分子单分子层吸附饱和，多糖分子过多，阻碍其他多糖分子进入树脂内部，影响多糖分子在树脂内部的扩散。并且当款冬多糖液浓度过于庞大时，会有沉淀产生，进而堵塞树脂影响吸附。所以考察纯化的工艺时，样液浓度要在0.3208 mg/mL左右。

图3 上样浓度对吸附效果的影响Fig.3 Effect of the above concentration on adsorption effect

3.2 上样速度对吸附效果的影响

由图4可以看出，当上样速度刚开始增加时，吸附率在增大。但是当上样速度增大到1.0 mL/min时，之后速度的增加导致XAD-7HP型树脂的吸附时间缩短，大量的多糖类化合物还来不及被树脂充分吸附便流出树脂柱，降低了吸附量。综合考虑，上样速度应该在1.0 mL/min左右为宜。

图4 上样速度对吸附效果的影响Fig.4 Effect of the above speed on the adsorption effect

3.3 不同洗脱浓度对洗脱效果的影响

从图5中可知，洗脱剂的体积分数不同，洗脱效果也有一定程度的差异的。可以看到，洗脱剂的体积分数为65%时洗脱效果最好，洗脱率最大。所以洗脱剂的体积分数65%为最佳。

图5 不同洗脱浓度对洗脱效果的影响Fig.5 Effect of different elution concentrations on elution effect

3.4 洗脱速度对洗脱效果的影响

由图6可以得到，刚开始随着洗脱速度的增加，洗脱率明显增大。但当洗脱速度超过1.0 mL/min时，随着洗脱速度的增加，洗脱率在明显的减小，这是当洗脱速度较慢时，能将多糖类化合物从XAD-7HP型树脂上充分的洗脱出来，但是随着洗脱速度的不断增加，有大部分的多糖类化合物来不及被洗脱下来。因此，在进行多糖溶液的洗脱时，我们应该选择适宜的洗脱速度，这样可以有一个较高的洗脱率。实验结果显示，当65%乙醇洗脱速度为1.0 mL/min时，可以得到较高洗脱率的效果。

图6 洗脱速度对洗脱效果的影响Fig.6 Effect of elution speed on elution effect

3.5 款冬花粗多糖的纯化

配制0.3208 mg/mL的款冬花粗多糖溶液，以1.0 mL/min的速度上样，采用 65%的乙醇以1.0 mL/min的流速进行洗脱，得最佳纯化多糖溶液，平行测定3次，计算得多糖纯度为72.98%。

4 结 论

大孔吸附树脂(MACROPROUS ADSORPTION RESIN，MAR)是一类重要的高分子聚合物分离材料，已成为中药产业带动面最广的共性技术和关键技术，但在中药多糖的大分子分离方面还处于起步阶段[2]。XAD7HP吸附树脂属弱极性吸附树脂，可有效吸附芳香类、酚类等脂类有机化合物，可以有效去除多糖色素，经过单因素实验可以得到XAD-7HP型树脂纯化款冬花多糖的最佳工艺为上样液浓度0.3208 mg/mL、上样速度 1.0 mL/min、洗脱剂乙醇的体积分数65%，洗脱速度 1.0 mL/min，在上述实验条件下，款冬花多糖的纯度达到了72.98%，纯化效果显著。XAD-7HP型树脂具有操作简单，溶剂消耗低，有毒溶剂残留少，纯化效率高等特点，为MAR分离技术和款冬花多糖的进一步研究提供了参考信息。