LncRNA HIF1A-AS1在增生性糖尿病视网膜病变中的表达及诊断价值

李丹丹，刘 戈，邹丽鑫，罗 杰

0 引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见的微血管并发症，也是导致成年人失明的重要原因[1-2]。DR分为非增生性糖尿病视网膜病变(nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR)和增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic relatinopathy，PDR)。PDR是视网膜缺血引起的新生血管形成以及纤维化，甚至视网膜脱离[3-4]，进展到高危PDR阶段的患者可能继发玻璃体出血或牵引性视网膜脱离而出现严重的视力丧失[5]。因此寻找能简单、有效判断PDR的生物学指标对于患者的早期诊治具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是由200多个核苷酸组成的非编码RNA，缺乏蛋白质编码能力，主要通过调节致癌和肿瘤抑制途径在肿瘤的发生、进展和转移中发挥关键作用[6]。近来，有研究表明LncRNA在眼部相关疾病中存在差异性表达，并对不同类型的眼部疾病有调控作用，提示LncRNA可作为诊断以及治疗眼部疾病的新靶点[7-8]。LncRNA缺氧诱导因子-1α-反义链1(hypoxia-inducible factor 1 alpha antisense RNA 1，HIF1A-AS1)位于人14号染色体缺氧诱导因子1α的反义链上，成熟体长度为652nt[9-10]。相关研究表明，HIF1A-AS1可以用于癌症、肿瘤以及心血管系统等疾病的诊断。此外，HIF1A-AS1在血管平滑肌细胞的体外增殖和凋亡中也起到关键作用[11]。而其与PDR的关系尚不清楚。因此，本研究旨在通过检测LncRNA HIF1A-AS1在PDR患者中的表达情况，分析LncRNA HIF1A-AS1在病程发展中的作用及临床意义。

1 对象和方法

1.1对象选取2019-07/2021-07本院收治的160例患者为研究对象，根据视网膜病变程度分为PDR组(80例)，男45例，女35例，年龄51～72(平均58.60±6.50)岁，NPDR组(80例)，男41例，女39例，年龄49～70(平均57.89±5.80)岁。纳入标准：(1)符合DR患者诊断标准，按照2014年中国眼底病学组制定的DR分期标准分为PDR组和NPDR组[12-13]；(2)无精神病病史。排除标准：(1)有既往其他眼部疾病如青光眼、葡萄膜炎、角膜混浊、角膜溃疡等；(2)有高血压疾病病史者；(3)有眼外伤及内眼手术史；(4)有恶性肿瘤、免疫疾病等患者；(5)临床资料不完整者。选取同期来本院的健康体检者100例为对照组，男56例，女44例，年龄50～71(平均57.60±5.71)岁。本研究经我院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得受试者知情同意。

1.2方法

1.2.1标本采集所有受试者于就诊当日采集空腹肘静脉血10mL，置于EP管中室温静置15min，放入离心机在3000r/min下离心处理10min，取上层血清置于EP管内，置于-80℃保存，备用。

1.2.2临床资料收集及生化指标测定收集所有研究对象的临床资料，分别记录年龄、性别、病程、体质量，检查血压(入院24h动态血压监测的收缩压和舒张压平均值)；采用糖化血红蛋白分析仪检测糖化血红蛋白(HbA1c)水平；常规血糖仪检测空腹血糖(FBG)；采用全自动生化仪检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。

1.2.3qRT-PCR法检测血清中LncRNAHIF1A-AS1水平采用TRIzol试剂(赛默飞公司)提取血清中总RNA，Nano Drop 2000超微量分光光度计(深圳市宇德立生物科技公司)检测浓度以及纯度后，利用PrimeScript RT-聚合酶(科邦兴业科技有限公司)将2μg总RNA逆转录为cDNA。以cDNA作为进行常规聚合酶链反应的模板，于qRT-PCR仪(美国Bio-Rad公司)进行扩增。循环参数为：95℃，30s，然后再95℃，5s，60℃，30s。共设40个循环。GAPDH作为内参基因，使用Primer 5.0引物设计软件，设计本研究所用引物，序列见表1。所有条件均按照检测系统严格进行，采用2-ΔΔCT法对血清LncRNA HIF1A-AS1表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1一般资料比较三组年龄、性别、体质量、收缩压、舒张压水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。PDR组的糖尿病病程高于NPDR组(P<0.05)，PDR组、NPDR组中HbA1c、FBG、TC、TG、LDL-C水平显著高于对照组，且PDR组高于NPDR组，差异均有统计学意义(P<0.05)。PDR组中HDL-C水平显著低于对照组和NPDR组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 三组一般资料比较

2.2三组血清中LncRNAHIF1A-AS1水平比较PDR组患者血清中LncRNA HIF1A-AS1水平(2.25±0.54)高于NPDR组(1.78±0.45)和对照组(1.56±0.32)，NPDR组高于对照组，差异有统计学意义(F=56.385，P<0.01)。

2.3PDR患者血清中LncRNAHIF1A-AS1水平与相关指标的相关性分析PDR患者血清LncRNA HIF1A-AS1水平与糖尿病病程、HbA1c、TC、TG、LDL-C、FBG呈正相关(r=0.478、0.278、0.391、0.361、0.356、0.276，均P<0.05)，与HDL-C呈负相关(r=-0.250，P=0.025)。

2.4ROC曲线分析LncRNAHIF1A-AS1水平预测PDR的诊断价值ROC结果显示，LncRNA HIF1A-AS1水平预测PDR发生的曲线下面积(area under the ROC curve，AUC)为0.766(95%CI：0.692～0.829)，对应的敏感度为66.25%，特异度为78.75%，见图1。

图1 LncRNA HIF1A-AS1水平预测PDR的ROC曲线。

2.5影响PDR发生的危险因素分析以是否发生PDR为因变量，单因素分析有意义的因素为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，LncRNA HIF1A-AS1、病程、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C均是PDR发生的危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响PDR发生的多因素Logistic回归分析

3 结论

近年，DM已成为全球公共卫生的负担[14]，研究表明几乎所有1型糖尿病患者和超过50%的2型糖尿病患者都会发生DR，且随着疾病的进展可能导致视网膜缺血并发展为威胁视力的PDR[15]。

本研究中LncRNA HIF1A-AS1水平在PDR患者血清中上调，表达水平高于NPDR患者和健康人群，王微等[20]研究表明高水平的LncRNA HIF1A-AS1提示机体处于氧化应激状态，这与本研究结果相符，结果提示LncRNAHIF1A-AS1表达水平升高可能会加速DR的进程，与PDR的发生有关，且与病变严重程度存在明显关联；而PDR组患者糖尿病病程高于NPDR组，PDR组、NPDR组患者HbA1c、TC、TG、LDL-C、FBG水平显著高于对照组，且PDR组HDL-C水平显著低于对照组，表明随着患者的病程进展，患者体内的代谢紊乱更加严重，且疾病的严重程度与血糖、血脂水平增高密切相关，这也与以往研究结果相一致[21]。研究发现LncRNA HIF1A-AS1在PDR患者中的表达与糖尿病病程、HbA1c、TC、TG、LDL-C、FBG呈正相关，与HDL-C呈负相关，提示病程越长、DR增生型病变越严重，患者LncRNA HIF1A-AS1相对表达量越高，LncRNA HIF1A-AS1可能通过影响糖脂代谢指标，进一步加重糖代谢紊乱，最终导致PDR的发生，可能作为诊断疾病严重程度的潜在标志；本研究Logistic回归分析结果显示，LncRNA HIF1A-AS1、病程、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C均是PDR发生的危险因素，提示临床应重视患者的自我管理，把血糖、血压、血脂控制到最佳水平，将有效降低PDR的发生率，对于LncRNA HIF1A-AS1表达升高的患者可给予恰当治疗；ROC结果显示，LncRNA HIF1A-AS1水平预测PDR发生的AUC为0.766(95%CI：0.692～0.829)，对应的敏感度为66.25%，特异度为78.75%，提示LncRNA HIF1A-AS1相对表达量可作为诊断PDR的潜在生物标志物，具有重要的临床价值。

综上所述，在PDR患者血清中LncRNA HIF1A-AS1水平上调，与患者病程密切相关，糖尿病病程、HbA1c、TC、TG、LDL-C、FBG、HDL-C均影响LncRNA HIF1A-AS1的表达，推测LncRNA HIF1A-AS1可能通过调控有糖代谢等途径参与PDR的发病及进展过程，LncRNA HIF1A-AS1可作为预测PDR发生的潜在指标，有望成为PDR防治研究的新方向，具有重要的临床意义，但其中存在的相关作用机制本研究尚未明确，尚需通过动物实验进行后续研究。

1周垂仁, 黄卫, 江玲. 糖尿病视网膜病变血清miR-146a与核转录因子-κB和VEGF的相关性. 国际眼科杂志 2018;18(8):1440-1442