达格列净对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护的实验研究

张 铭，张娜娜，余 信，周国琼,李 静

(1.西安交通大学医学院附属红会医院，陕西 西安710054；2.陕西省人民医院中医科，陕西 西安710068)

全球近三分之一的死亡是由心血管疾病引起[1]，其中，急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是心血管疾病死亡的主要原因。AMI是由于动脉内壁形成的斑块导致流向心脏的血液减少，心肌组织因缺血缺氧而导致心肌细胞死亡[2]。目前AMI的治疗方法是尽早开通血管恢复心脏的血液灌注，这一过程被称为再灌注[3]。再灌注可通过外科手术和经皮冠状动脉介入球囊血管成形术[4-5]，或抗血小板、抗血栓治疗来完成[6-7]。然而，再灌注本身又可引起心肌细胞死亡和梗死面积增大，从而增加AMI患者的病死率，这一过程被称为“缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion，I/R)损伤”[8]。因此，心脏I/R损伤后保护心肌组织的治疗可能有助于在结构和功能上保护AMI患者的心脏。

钠-葡萄糖共转运蛋白2 (Sodium glucose cotransporter 2，SGLT-2)抑制剂是一种治疗糖尿病的新药，已被证明具有良好的代谢特征， 最初认为SGLT-2抑制剂只是一种降糖药物，但其作用已经远远超出了这一范围[9-10]。 EMPA-REG试验研究报告了SGLT-2抑制剂对心血管的益处， SGLT-2抑制剂可促进糖尿的排出，从而降低葡萄糖毒性和体重，并增强利钠，从而降低血压，可显著降低心力衰竭患者的住院率，减少动脉粥样硬化事件、心血管疾病的总病死率，还可控制慢性肾脏疾病的进展[11-12]。尽管SGLT-2抑制剂对心血管的益处从血流动力学和全身代谢方面进行了解释，但对心脏潜在的保护机制尚不明确。本研究旨在探讨在心脏I/R损伤3个不同时间点急性给药达格列净对大鼠心肌梗死面积及心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性大鼠40只,250～300 g,8周龄，购自长沙天勤生物公司[SCXK( 湘) 2019-0013 ],驯化7 d后接受同等程度的心脏I/R刺激。40只随机分为四组，每组10只。①预处理组：在心肌缺血前15 min快速给予达格列净；②缺血组：在心肌缺血开始15 min后快速给予达格列净；③再灌注组：再灌注开始时快速给予达格列净；④对照组：给大鼠生理盐水作为对照。将达格列净溶于生理盐水中(1 mg /kg溶于1 ml生理盐水)，定位大鼠左侧股静脉，注入达格列净注射液。从右侧颈动脉插入P-V导管至左室，评估心功能。记录室速(VT)/室颤(VF)首次发生的时间，对心律失常进行量化分析。在I/R损伤结束时，立即切除心脏，以便对心肌高风险区和心肌梗死面积的测量。

1.2 实验方法

1.2.1 心肌缺血再灌注模型:用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)对大鼠进行麻醉，通过呼吸模式、眼睛和脚蹬反射的测定，密切监测麻醉水平。对大鼠进行气管插管，接动物专用简易呼吸机，接心电图并记录Ⅱ导联心电图。开胸、切开心包，暴露大鼠心脏，结扎左冠状动脉前降支(LAD)致心肌缺血30 min，通过心外膜发绀和心电图ST段抬高，证实成功的冠状动脉闭塞和MI起始。解除LAD结扎后心脏恢复再灌注120 min[13-14]。心电图ST段压低证实再灌注，左心室区出现局部充血，之前是局部缺血，颜色苍白。

1.2.2 心律失常参数与左室功能测定:根据朗伯斯公约指南[15]对心律失常进行量化，分析每只大鼠缺血性心律失常发作的差异。

1.2.2.1 左室功能测量：在心脏I/R损伤时，定位右侧颈动脉，插入P-V环导管至左室，评估左室功能。采用Labscribe程序测定心率(HR)、左室收缩压和舒张压(LVESP和LVEDP)、左室内压变化率(dp/dtmax)、左室舒张期压力下降最大变化率(dp/dtmax)、每搏输出量(SV)和左室射血分数(LVEF)[13-15]。P-V环数据分析:①选择缺血前50个循环作为基线；②冠脉闭塞结束时选择50个循环代表缺血期；③再灌注结束时选择50个循环代表再灌注期。

1.2.2.2 梗塞尺寸测量:再灌注120 min后将伊文思蓝注入大鼠主动脉内，然后处死大鼠，快速取出心脏。评估左室危险区域(AAR)面积。将心脏置于-20 ℃的低温下，第2天早晨取出后切片，厚度为1～2 mm。将切片后的心脏浸泡于2,3,5-三苯基四唑(TTC)缓冲盐水中。TTC染色区域为活组织，用红色染色检测。梗死面积由白色区域确定，没有任何染料染色。使用图像分析程序对梗死面积(IS)和高风险区域面积(AAR)的百分比进行计算，各心脏的AAR值和IS值通过对切片数据进行汇总并计算平均值得到。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计学分析。实验数据分析均按随机化进行。数据以均数±标准差表示，用单因素方差分析和t检验来测试组间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 达格列净对各组心肌梗死面积的影响 达格列净在缺血再灌注大鼠模型中对心肌高风险区面积的影响，实验结果预处理组、缺血组、再灌注组与对照组比较差异没有统计学意义(均P>0.05)，说明四组之间心肌高风险面积大小无差异。达格列净在缺血再灌注大鼠模型中对心肌梗死面积的影响时，发现给予达格列净治疗后，预处理组和缺血组与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05)，可显著减少心肌梗死的面积；再灌注组与对照组比较差异没有统计学意义(P>0.05)，心肌梗死面积没有显著减少。见表1。

表1 达格列净对各组心肌梗死面积的影响(%)

2.2 达格列净对各组心肌I/R期间心律的影响 考察达格列净对I/R期间心律的影响，结果发现预处理组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明在缺血前期给予达格列净可延长大鼠第1次发生VT/VF的时间，减少心脏I/R损伤心律失常的频次。而缺血组和再灌注组与对照组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。说明在缺血时以及再灌注时给予达格列净治疗并不能延长大鼠第1次发生VT/VF的时间,减少I/R期间的心律失常。见表2。

表2 达格列净对各组I/R期间心律的影响(min)

2.3 达格列净对心肌I/R损伤时左室功能的影响 考察达格列净对心肌I/R损伤时左室功能的影响，结果发现LV功能在基线时四组之间各参数比较差异没无统计学意义(均P>0.05)。LAD闭塞后，每搏输出量(SV)、dp/dtmax、dp/dtmin和左室射血分数(LVEF)均逐渐下降，舒张末期压逐渐升高(图1A-F)。给予达格列净治疗后，缺血组和再灌注组与对照组比较，在HR、SV、dp/dtmax、dp/dtmin以及LVEF等参数上差异没有无统计学意义(均P>0.05)，预处理组与对照组比较，在HR、SV、 ESP、dp/dtmin等参数上没有统计学差异(均P>0.05)；而在EDP、dp/dtmax和LVEF%参数上比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。达格列净处理的预处理组dp/dtmax和LVEF%有所改善(图1E、G)。

A:HR(次/min);B：SV(μl);C：ESP(mmHg);D：EDP(mmHg);E：dp/dtmax(mmHg/s×103);F：dp/dtmin(mmHg/s×103);G：LVEF%

3 讨 论

缺血心肌的快速再灌注在几十年前就被确立为是一种非常有益的心肌梗死治疗方法，但在再灌注恢复后仍会发生明显的心肌细胞死亡。因此，心脏I/R损伤是AMI发病和死亡的重要原因。目前我们的实验研究还没有发现直接有效的治疗方法来保护心脏免受IR损伤。因此，有必要发现或开发新的策略来预防心肌再灌注损伤，以改善心血管患者的临床结局。EMPA-REG试验揭示了SGLT-2抑制剂在降血糖的同时对患者心血管事件的影响，它对心脏的保护作用是通过降低血糖、血压、改善血管弹性、通过尿钠的排出减少心脏负荷、降低体重等全身作用而发挥心脏保护作用[16-19]。

本研究发现了达格列净的益处可能主要是由于其对心脏的直接作用，因为它是在心脏I/R损伤前15 min才给予大鼠。本实验研究通过以下几个方面的数据:①LVEF %增加，LV功能得到改善；②首次VT/VF发生时间的延迟；③心肌梗死面积的减小，表明在心脏I/R损伤期间，急性给药达格列净可直接发挥心脏保护作用，改善心功能，并且在I/R损伤不同时间点给药，发挥的心脏保护作用是不同的。我们的研究证实，在心脏I/R损伤前急性给药达格列净可以减少心肌梗死面积约38%，在心脏缺血期间急性给药达格列净可以减少心肌梗死面积约14%。除梗死面积减少外，研究还证实，与对照组相比，缺血前急性给药达格列净可使大鼠VT/VF的首次发病时间明显延迟，心律失常的频次减少，左室功能参数LVEF、dp/dtmax有所改善。因此，在心脏I/R损伤前急性给药达格列净可通过减少心肌梗死面积、控制心律失常来发挥心脏保护作用，通过提高LVEF、dp/dtmax来改善左室功能。

缺血/再灌注损伤是一种严重的疾病，对我们医生提出了一个重要的治疗挑战，人们已经在I/R损伤的途径及引起的代谢紊乱方面做了大量的工作。SGLT-2抑制剂对心脏的直接保护作用可能是通过改善心肌局部炎症、活性氧的失控生成而减少心肌细胞凋亡、自噬、坏死，使活性心肌细胞得到保护，通过降低心肌氧化应激、纤维化和心脏重构的途径使心肌梗死面积得到减少，通过维持线粒体的正常生物功能和细胞能量代谢等途径而控制心律失常、改善心功能[20-22]，目前还需要我们进一步实验研究以证实。这些发现可以为今后急性心肌梗死患者使用达格列净的临床研究提供重要的依据。