甲状腺乳头状癌钠碘转运体表达与BRAFV600E突变的相关性研究

李小妹 ，王利利，李 想 ，杜丽艳

甲状腺乳头状癌(PTC)是最常见的甲状腺癌病理类型，约占所有类型的80%。最新调查结果显示，过去的30年间，全球PTC的发病率增加了约58%，因此对于PTC临床和基础研究的价值逐渐凸显[1]。作为一种内分泌肿瘤，PTC受到多种基因影响，尤其是BRAFV600E基因突变被认为是目前最常见的基因变异，在PTC形成过程中发挥重要作用，影响其发生、侵袭及预后，被公认为是PTC最主要的不良影响因子之一[2]。131I是PTC的主要治疗方法，其发挥杀伤肿瘤细胞的效应依赖细胞基底膜表达的钠碘转运体(NIS)，以保证细胞必须具有较强的摄碘能力，然而，NIS在PTC组织内的表达是下降或者缺失的，从而导致131I治疗效果不佳，也有研究[3]表明BRAF突变可能影响NIS蛋白表达，因此本文将继续探讨PTC中常见的遗传学事件BRAFV600E突变与NIS表达的相互关系，为PTC病人放射性131I治疗效果的预测提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2019年1月我院收治104例行手术治疗的PTC病人，其中男25例，女79例，年龄23～68岁，平均年龄(42.5±3.9)岁，留取全部病人术中新鲜PTC组织标本和癌旁正常组织标本进行观察研究，组织标本均分成2份，1份置于液氮中保存，1份置于10%甲醛溶液中固定后用于免疫组织化学(免疫组化)检测。

1.2 纳入标准 (1)标本均经2位病理科高资历医生确认为PTC病例；(2)术前未进行甲状腺素类药物、生物制剂、放射及手术治疗；(3)癌旁正常组织标本选择准确，排除桥本性甲状腺炎等病理类型干扰；(4)术前完善颈部彩超及甲状腺功能检查；(5)病人及家属知晓研究目的，并签署知情同意书。

1.3 BRAFV600E基因突变检测 全部病理标本经石蜡处理后经10%中性甲醛固定。复查HE切片，并选择合适的石蜡标本进行试验研究，5 μm厚度连续切片，每例样本5片，置于1.5 mL Eppendorf管中，寄送上海生工生物工程有限公司，采用Sanger测序技术对组织样本进行测序(Sanger测序仪ABI3730，德国Qiagen 公司)

1.4 Real-Time PCR检测NIS mRNA表达 取PTC组织2 g，立即置液氮中，-70 ℃保存待用。采用TRIzol试剂盒(Gibco) 提取PTC组织总RNA，用作Real-Time PCR模板。反转录合成cDNA 第一链，准备八联排，倒转反应预混试剂管，短暂离心管，使内容物沉积并除去气泡，吸取反应预混试剂到八联排每一个孔中，样本吸取至反应孔中，用光学盖膜覆盖八联排，将八联排置于冰上，直到将其装入定量PCR ABI7500仪。

1.5 免疫组织化学(免疫组化)

1.5.1 免疫组化步骤 石蜡包埋标本切片，厚度为5μm，进行组织化学染色。应用PV-6000-G二步法免疫组化，具体步骤为：脱蜡、水化；3%H2O2去离子水孵育5 min，抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗2～3 min；滴加一抗(NIS)4 ℃过夜后37 ℃复温，PBS洗3次各2～3 min；滴加通用型IgG(二抗)37 ℃孵育15 min，PBS洗3次各2～3 min；应用DAB显色；蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片。

1.5.2 免疫组化评定标准 阳性结果判断标准[4]:NIS蛋白表达定位于甲状腺滤泡上皮细胞基底部质膜、周边质膜侧或细胞质，染色呈淡黄色到棕褐色不等。以PBS代替一抗作为阴性对照，以癌旁正常甲状腺组织作为阴性对照。

1.6 统计学方法 采用秩和检验和χ2检验。

2 结果

2.1 PTC BRAFV600E基因突变情况分析 BRAFV600E基因突变检测标本共104例，结果表明，BRAFV600E基因突变型共70例，突变率为67.3%，野生型34例，突变率为32.7%，同样来源于104例PTC观察对象的癌旁正常组织一起进行BRAFV600E基因突变检测，结果提示均为野生型。组间突变率比较差异明显(χ2=105.51,P<0.01)。

2.2 不同甲状腺组织NISmRNA和NIS蛋白表达 所提取的总RNA经微量核算定量分析仪检测浓度，结果提示：PTC组织中NISmRNA的表达浓度低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.01)。与癌旁正常组织相比，NISmRNA表达下调90例(86.5%)，14例表达上调(13.5%)。免疫组化检测结果显示，PTC组织中，NIS蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织(P<0.01)(见表1)。

2.3 不同甲状腺组织中NISmRNA及NIS蛋白表达的关系 荧光定量PCR检测及免疫组化分析发现，与癌旁正常组织比较，PTC组织中NISmRNA表达下降的同时，有76例NIS蛋白表达上调，14例NIS蛋白表达下调，NISmRNA表达上调时，14例NIS蛋白表达上调，PTC组织中NISmRNA表达下调同时NIS蛋白表达上调的比例明显高于癌旁正常组织。

2.4 PTC NISmRNA及NIS蛋白表达与BRAFV600E基因突变的关系 PTC BRAFV600E基因突变病人NISmRNA表达浓度为1.57×106copies/mL，明显低于野生型NISmRNA表达浓度1.74×106copies/mL，差异有统计学意义(P<0.01)；PTC BRAFV600E基因突变病人中NIS蛋白表达阳性者49例，阳性率为70.0%，野生型病人中NIS蛋白表达阳性者28例，阳性率为82.4%，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 PTCNISmRNA及NIS蛋白表达与BRAFV600E基因突变的关系

3 讨论

近年来，相关研究中通过基因组技术和癌基因的筛查发现BRAF基因是特异性较强的PTC基因，BRAF突变也是目前PTC中最为常见的基因变异，表现为第15外显子上第1 799位核苷酸上的胸腺嘧啶(T)转换为腺嘌呤(A)，导致蛋白质产物中第600位的織氨酸(V)转换为谷氨酸(E)所致[2]。国外报道称PTC中BRAFV600E基因突变发生率明显高于其他相关通路蛋白编码基因，为28%～80%，且其突变率可能与病人年龄、地区分布及检测方法相关[5]。本研究中共104例PTC标本中，BRAFV600E基因突变率为67.3%，与西方国家的报道值相比偏高，但是与韩国等亚洲国家的报道水平相当[6]，考虑可能为种族因素所导致，同时也与样本数量、纳入标准及检测方法相关，如本研究中我们的全部纳入对象均为单纯PTC诊断，无并发桥本甲状腺炎病人，同时并未对病理分期进行筛选，这与其他文献中的纳入对象存在性质差异。同时我们观察到虽然癌旁正常组织中无BRAFV600E基因突变发生，但PTC组织中依然存在约30%以上的假阴性可能，因此说明BRAFV600E基因突变检测在目前只适用于特异性诊断。而ZATELLI等[7]2009年的研究中也特别提出，BRAFV600E基因突变检测可提高病理诊断敏感性，但对于PTC诊断的局限性不可忽视。

NIS是钠-葡萄糖共转体家族的一种膜蛋白,它主要介导碘的转运,NIS对碘的摄取和浓集作用是甲状腺激素合成的主要步骤，PTC病人甲状腺细胞残留一定水平的摄碘功能，这也是临床上131I治疗的理论基础，但最近研究发现部分病人由于甲状腺细胞“去分化”失去聚碘功能，导致131I初治或复治的效果不佳[8]，BASTOS等[9]研究中发现NIS表达强度低于正常组织，于是认为是NIS低表达或不表达所致，而某些研究则提出相反结论，认为NIS是正常表达，甚至过度表达，但定位错误，使细胞质中的表达与膜表达颠倒而出现功能障碍。本研究中，NIS蛋白表达强度明显高于癌旁正常组织，且发现NIS蛋白多定位于基膜两侧或细胞质中，与既往的研究结论基本一致，而与相反结论的研究对比分析，认为可能是其他调节因子调控作用所造成的差异[10]。同时本研究结果中NISmRNA表达水平为1.56×106copies/mL，与癌旁正常组织相比水平较低，分析原因认为这种看似不合理的现象可能与各因素对于转录及转录后同时施加影响所致。

BRAFV600E基因突变的遗传学事件和NIS表达之间是否存在联系？2012年高卫厉[11]研究发现，与野生型相比较，BRAFV600E基因突变型PTC病人对于131I治疗的效果较差，2017年茹晓婷等[12]进一步研究说明，BRAFV600E基因突变可通过TGF-β等因子介导影响NIS正常表达秩序，在破坏甲状腺细胞正常摄碘能力的同时，加重PTC病人恶性程度。本研究中我们发现，BRAFV600E基因突变型PTC病人NISmRNA表达水平低于野生型，但是在NIS蛋白表达强度比较中则无明显差异，这可能与样本量，免疫组化石蜡组织中癌组织偏小等有关，但同时也说明对于野生型PTC病人其131I治疗效果可能相对较佳。

综上所述，PTC病人中BRAFV600E基因突变的发生，可作为重要的遗传学事件独立预测PTC的预后，指导基因靶向治疗，同时BRAF与NIS之间紧密的生物学行为联系，可使BRAF成为PTC病人131I治疗疗效新的预测指标，我们会继续跟进研究。