miR-431-5p通过调控AKT1抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡研究

汪俊州，王义刚，孙雅轩

胰腺癌发病隐匿、进展速度快，且预后较差[1-2]。目前，胰腺癌的发病机制尚不明确，基因靶点治疗是胰腺癌研究的热点。微小RNA(micro RNA，miRNA)可在转录后调控靶基因的表达，参与细胞增殖、凋亡、转移和分化等过程[3]。miR-431-5p在肺癌等肿瘤中表达下调，靶向上调其表达可抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成[4-6]，但其对胰腺癌细胞生物学行为的影响及其作用机制目前还不清楚。Targetscan生物信息学软件预测显示，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)可能是miR-431-5p的靶基因。AKT1已被确定在胰腺癌等多种肿瘤中发挥致癌基因作用[7]。但miR-431-5p能否通过调控AKT1影响胰腺癌细胞的生物学行为尚不清楚。本研究主要探讨了miR-431-5p对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其能否通过调控AKT1表达发挥作用，以期为寻找胰腺癌治疗潜在的分子靶点提供参考。现作报道。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞株PANC-1、CFPAC-1和人正常胰腺细胞株hTERT-HPNE购自美国ATCC；DMEM高糖培养基、牛血清白蛋白、胰蛋白酶Trypsin、二甲基亚矾(DMSO)和四氮唑蓝(MTT)购自Sigma-Aldrich公司；Transwell板购自美国Corning公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Gibco公司；Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂Trizol、 real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自美国Invitrogen公司；Annexin V-FITC流式法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；miR-431-5p 模拟物(mimics)及模拟对照序列(miR-NC)、miR-431-5p抑制剂(anti-miR-431-5p)及阴性对照序列(anti-miR-NC)、AKT1过表达载体(pcDNA3.1-AKT1)及空载体(pcDNA3.1)购自上海吉玛制药技术有限公司；双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司；显微镜、酶标仪、发光仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 PANC-1、CFPAC-1和hTERT-HPNE细胞均用含10% FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基培养。培养箱环境：温度37 ℃、CO2体积分数5%、湿度95%。待细胞生长密度至80%左右时，Trypsin消化，进行传代培养。

1.2.2 细胞转染和分组 对数生长期的CFPAC-1细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔板中。待细胞生长密度至60%时，更换为不含FBS的DMEM高糖培养基。参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书，分别将miR-NC(miR-NC组)、miR-431-5p mimics(miR-431-5p组)、anti-miR-NC(anti-miR-NC组)、anti-miR-431-5p(anti-miR-431-5p组)、miR-431-5p mimics与pcDNA3.1(miR-431-5p +pcDNA3.1组)、miR-431-5p mimics与pcDNA3.1-AKT1(miR-431-5p+pcDNA3.1-AKT1组)转染至CFPAC-1细胞。转染6 h后，弃培养液，换成含10% FBS DMEM高糖培养基。继续培养至48 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.3 Real-time PCR检测RNA的表达 收集各组CFPAC-1细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，然后根据反转录试剂盒说明书合成cDNA，反应程序为：50 ℃ 10 min；37 ℃ 50 min；72 ℃ 10 min。测定浓度和纯度，-80 ℃保存。取cDNA为模板，按照 real-time PCR试剂盒的说明书进行反应，反应程序为：94 ℃ 4 min；90 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，40个循环；72 ℃ 5 min。引物如下：miR-431-5p 上游5′-ACG CGT GTC TTG CAG GCC GT-3′，下游5′-ATC CAG TGC AGG GTC CGA GG-3′；AKT1上游5′-TCT ATG GCG CTG AGA TTG TG-3′，下游5′-CTT AAT GTG CCC GTC CTT GT-3′。运用Bio-Rad PCR系统进行数据分析。

1.2.4 MTT实验检测细胞增殖 miR-NC组、miR-431-5p组、miR-431-5p +pcDNA3.1组和miR-431-5p+pcDNA3.1-AKT1组细胞，以每孔2×103个细胞接种于96孔板中。分别培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入 20 μL MTT溶液(5 mg/mL)。培养箱中继续培养4 h后，弃上清液，加入150 μL DMSO，室温振荡5 min，酶标仪测定490 nm 吸光度(OD)值。

1.2.5 流式细胞术测定细胞凋亡 miR-NC组、miR-431-5p组、miR-431-5p +pcDNA3.1组和miR-431-5p+pcDNA3.1-AKT1组细胞，以每孔1×104个接种于6孔板中。培养48 h后，Trypsin消化，收集细胞。按照Annexin V-FITC凋亡试剂盒说明书，加入5 μL Annexin V-FITC，混匀后室温孵育10 min。加入5 μL 碘化丙啶，混匀后室温孵育10 min，上流式细胞仪检测。

1.2.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 miR-NC组、miR-431-5p组、miR-431-5p +pcDNA3.1组和miR-431-5p+pcDNA3.1-AKT1组细胞用不含FBS的DMEM高糖培养基稀释为每毫升2×105个。迁移实验：Transwell小室置于24孔板中，上室加入100 μL稀释后的各组细胞悬液，下室加入500 μL含10% FBS的DMEM高糖培养基。培养48 h后，吸弃培养基。取出小室，棉签拭去上层小室的细胞，4 %甲醇固定细胞30 min，0.4 %结晶紫染色15 min。显微镜观察，随机选取5个视野，计数迁移细胞。侵袭实验：Matrigel基质胶4 ℃融化后，无血清DMEM高糖培养基1∶8比例稀释，然后铺于Transwell小室上层。自然晾干后，加入100 μL稀释后的各组细胞悬液，下室加入500 μL含10% FBS的DMEM高糖培养基。后续操作与迁移实验相同。

1.2.7 Western blotting法检测细胞中Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2和AKT1蛋白表达 miR-NC组、miR-431-5p组、miR-431-5p+pcDNA3.1组和miR-431-5p+pcDNA3.1-AKT1组细胞，以每孔1×104个接种于6孔板中。培养48 h后，Trypsin消化，收集细胞。加入RIPA细胞裂解液，提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白溶液，100 ℃煮沸5 min。蛋白变性后，每孔25 μg蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳后，电转移至聚偏乙烯二氟(PVDF)膜，于5%脱脂奶粉中封闭2 h。分别置于 Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2和AKT1一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，置于辣根过氧化酶标记的二抗孵育液中，37 ℃孵育1 h。TBST洗膜，加入ELC显影液，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.2.8 双荧光素酶报告实验 PCR扩增含miR-431-5p结合位点的AKT1的基因序列，分别构建的AKT1的野生型(WT-AKT1)和突变型(MUT-AKT1)双荧光素酶报告载体，由上海吉玛制药技术有限公司完成。CFPAC-1细胞以2×105个接种于6孔板中，待细胞生长密度至60%时，更换为不含FBS的DMEM高糖培养基。参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书，分别将WT-AKT1、MUT-AKT1与miR-431-5p mimics或miR-NC共转染至CFPAC-1细胞。转染6 h后，更换含10% FBS的DMEM高糖培养基。继续培养至48 h，收集细胞，加入RIPA细胞裂解液充分裂解细胞，收集上清液。参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法 采用独立样本t检验、单因素方差分析和q检验。

2 结果

2.1 miR-431-5p在胰腺癌细胞PANC-1、CFPAC-1和正常胰腺上皮细胞hTERT-HPNE中的表达 qRT-PCR结果表明，与hTERT-HPNE细胞相比，胰腺癌细胞PANC-1和CFPAC-1组的miR-431-5p表达量降低，且CFPAC-1细胞miR-431-5p表达量低于PANC-1组，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表1)，因此，选用胰腺癌细胞株CFPAC-1进行后续实验。

表1 miR-431-5p在PANC-1、CFPAC-1和hTERT-HPNE细胞中的表达

2.2 过表达miR-431-5p抑制胰腺癌CFPAC-1细胞增殖、促进细胞凋亡 qRT-PCR结果表明，与miR-NC组相比，miR-431-5p组细胞中miR-431-5p表达量上升(P<0.01)，表明miR-431-5p mimics转染成功，细胞中miR-431-5p过表达。MTT、流式细胞术结果显示，与miR-NC组相比，miR-431-5p组细胞活性在48 h、72 h均下降，细胞凋亡率上升，Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达下调，p21和Bax蛋白表达上调，差异均有统计学意义(P<0.01)(见图1、表2)。

表2 过表达miR-431-5p对细胞 CFPAC-1增殖、凋亡的影响

2.3 过表达miR-431-5p抑制胰腺癌细胞CFPAC-1迁移、侵袭 Transwell结果显示，与miR-NC组相比，miR-431-5p组细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均下降，E-cadherin蛋白表达上升，N-cadherin蛋白表达下降，差异均有统计学意义(P<0.01)(见表3、图2)。

表3 过表达miR-431-5p对细胞CFPAC-1迁移、侵袭的影响

2.4 miR-431-5p靶向调控AKT1 Targetscan软件预测结果显示，AKT1的3′UTR含有与miR-431-5p互补的核苷酸序列(见图3)。双荧光素酶报告系统结果所示，与共转染WT-AKT1的miR-NC组相比，共转染WT-AKT1的miR-431-5p组荧光素酶相对活性下降(P<0.01)(见表4)；与共转染MUT-AKT1的miR-NC组相比，共转染MUT-AKT1的miR-431-5p组荧光素酶相对活性差异无统计学意义(P>0.05)；Western blotting结果表明，与miR-NC组相比，miR-431-5p组的AKT1 蛋白表达量下降(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-431-5p组的AKT1 蛋白表达量上升(P<0.05)(见表5和图4)。

表5 miR-431-5p调控AKT1蛋白的表达

表4 双荧光素酶报告实验

2.5 过表达AKT1逆转miR-431-5p对胰腺癌细胞CFPAC-1增殖、凋亡的作用 MTT、流式细胞术、Western blotting结果显示，与miR-431-5p+pcDNA3.1组相比，miR-431-5p+pcDNA3.1-AKT1组细胞增殖活性上升，细胞凋亡率下降，AKT1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达上升，p21和Bax蛋白表达下调，差异均有统计学意义(P<0.05)(见图5、表6)。

表6 过表达AKT1逆转miR-431-5p对细胞CFPAC-1增殖、凋亡的作用

2.6 过表达AKT1逆转对miR-431-5p对胰腺癌细胞CFPAC-1迁移、侵袭的作用 Transwell、Western blotting结果显示，与miR-431-5p+pcDNA3.1组相比，miR-431-5p+pcDNA3.1-AKT1组的CFPAC-1迁移细胞数和侵袭细胞数均上升，E-cadherin蛋白表达量下降，N-cadherin蛋白表达量上升，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表7、图6)。

表7 过表达AKT1能逆转miR-431-5p对细胞CFPAC-1迁移、侵袭的作用

3 讨论

miRNA是一类小分子非编码RNA，参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为，是肿瘤治疗的潜在分子靶点[8-10]。KONG等[11]研究发现，miR-431-5p在肝癌组织和细胞系中表达下调，过表达miR-431-5p可通过靶向UROC28影响EMT过程，抑制肝癌细胞增殖和侵袭。但也有报道[12]称，过表达miR-431-5p靶向下调Smad4促进肺癌细胞增殖，并抑制肺癌细胞凋亡，发挥促癌基因作用。目前，miR-431-5p对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响还未明确。

本研究发现，miR-431-5p在胰腺癌细胞中表达量显著降低，过表达miR-431-5p可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，提示miR-431-5p在胰腺癌中发挥抗癌基因作用，是胰腺癌治疗的潜在分子靶点。为了进一步探讨miR-431-5p影响胰腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用机制，本研究通过生物信息学软件预测显示，AKT1可能是miR-431-5p生物靶基因。通过双荧光素酶报告基因实验显示，miR-431-5p可与AKT1的3′UTR靶向结合。此外，过表达CFPAC-1细胞中miR-431-5p表达后，AKT1蛋白表达降低；而沉默miR-431-5p表达后，AKT1蛋白表达升高。这些结果证实了miR-431-5p靶向负调控AKT1表达。

AKT1在多种肿瘤组织中表达异常，与肿瘤增殖、进展和放化疗耐受有关[13-15]。研究[16]显示，薯蓣皂苷通过上调miR-149-3p表达进而靶向抑制AKT1表达，降低了胰腺癌细胞的增殖能力，并促进细胞凋亡。非小细胞肺癌组织中miR-512-3p表达降低，其通过靶向上调AKT1促进非小细胞肺癌细胞增殖[17]。本研究发现，过表达AKT1可逆转上调miR-431-5p对胰腺癌CFPAC-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用，提示过表达miR-431-5p通过靶向下调AKT1抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。

综上所述，miR-431-5p在胰腺癌细胞中呈低表达，过表达miR-431-5p可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，其可能通过靶向抑制AKT1发挥作用，miR-431-5p/AKT1轴为胰腺癌的分子靶向治疗提供了新的方向。