VAV1是动脉粥样硬化预后的潜在靶点和生物标志物

谢思安，徐俊玄，宁婷婷，张 楠，朱圣韬，刘 思

(首都医科大学北京友谊医院 消化内科，北京 100050)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种血管壁的慢性炎性反应性疾病，以动脉粥样硬化斑块的发展为特征，导致动脉腔的硬化和狭窄[1]。动脉粥样硬化是许多心血管疾病的基础，包括心肌梗死、外周动脉疾病和冠状动脉疾病，是全球首要死亡原因[2]。识别预后标志物和潜在药物靶点以提高预后和个体化治疗的互为必要。

鸟嘌呤核苷酸交换因子1(vav guanine nucleotide exchange factor 1，VAV1)是一种核苷酸交换因子，调节细胞骨架排列、细胞运动和细胞黏附的功能。VAV1最初被认为是一种致癌基因，在多种肿瘤的发生发展中起重要的调控作用[3]。随着研究的深入，VAV1被发现是一种重要的信号传导分子，在细胞生长和分化的过程中起关键调控作用[4]。研究表明VAV1在调控泡沫细胞功能过程中起重要作用。研究表明VAV1/RAC1通路影响巨噬细胞骨架和细胞迁移，抑制此通路可减少斑块形成，促进巨噬细胞向淋巴结迁移，抑制巨噬细胞来源的泡沫细胞的迁移能力[5]。然而其在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中的作用还尚未有研究。

本研究通过基因表达汇编(gene expression omnibus,GEO)数据库中获得的3组AS测序数据集中筛选出VAV1在动脉粥样硬化斑块的形成和发展过程中表达显著上升；通过体外VSMCs培养及功能实验来探究VAV1对VSMCs收缩功能和增殖能力的调控，为动脉粥样硬化的早期诊断及治疗提供一个潜在的新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:F-12培养基(Hyclone公司)；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；平滑肌细胞生长因子(Cell Application公司)；青链霉素混合液(北京华中海威基因科技公司)；小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)(苏州吉玛生物科技有限公司)； 蛋白分子质量标志物、BCA蛋白定量试剂盒、Trizol(Thermo Fisher Scientific公司)；Lipofectamine2000转染试剂、OPTI-MEM培养基、重组核糖核酸酶抑制剂、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠 IgG、Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG(Invitrogen公司)；M-MLV反转录酶、dNTP Mix(Promega公司); 引物(上海生工生物工程股份有限公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技术公司)；蛋白酶抑制剂(Roche 公司)；2 X SYBR Mix、5X蛋白质上样缓冲液(北京康润诚业生物科技公司)；脱脂奶粉(BD公司)；抗GAPDH抗体、抗SMMHC抗体、抗SM22α抗体、抗VAV1抗体(Proteintech公司)；鼠尾 Ⅰ 型胶原溶液(Corning公司)；增强化学发光体系 (BIO-RAD公司)；EdU检测试剂盒(CellLight公司)；高脂饲料(Research Diet公司)。

1.1.2 细胞及实验动物:人脐动脉平滑肌细胞(human umbilical artery smooth muscle cells，HUSMCs)购自上海中乔新舟生物有限公司。C57/BL6小鼠(WT型)和ApoE-/-小鼠(C57/BL6背景)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 生物信息学分析方法

1.2.1 AS样本测序数据获取及差异表达基因筛选:由GEO数据库中获得3组AS样本测序数据集，包括GSE57691、GSE28829和GSE43292。GSE57691包含10个正常对照主动脉血管和9个主动脉硬化闭塞症血管组织样本。GSE28829包含13个早期动脉粥样硬化和16个进展期动脉粥样硬化斑块样本，GSE43292包含32个对应的斑块周旁颈动脉和32个来自动脉内膜切除术取出的颈动脉斑块组织。使用GEO2R分析工具筛选3组数据集中的差异表达基因(different expression genes, DEGs)后，通过Jvenn分析网站(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)进行取交集并绘图，获得3组数据集中均有表达显著变化的DEGs，其中|logFC|>1及P<0.05被认定具有统计学意义。

1.2.2 DEGs的PPI网络(protein-protein interaction networks)构建与Hub基因筛选:使用STRING网站(https://www.string-db.org/)筛选基因间交互评分≥0.6的DEGs，去除没有基因交互作用的基因后，获得PPI网络图。进一步通过Cytoscape软件构建并可视化分析PPI网络并通过基因中心性筛选Hub基因。

1.2.3VAV1鉴定:毒性与基因比较数据库(comparative toxicogenomics database，CTD；https://ctdba se.org/)，用于发现识别化学基因、化学疾病和基因疾病的相互作用，以生成扩展的网络并预测新的关联。通过CTD数据库对VAV1进行鉴定，获取VAV1参与人类疾病过程的相关性数据。

1.3 生物学实验验证

1.3.1 细胞培养及siRNA转染:细胞在含10%胎牛血清、10%平滑肌细胞生长因子和青霉素/链霉素 (1 000 U/mL) 的F-12培养基中培养。应用于实验的细胞应在细胞解冻后传代至少2代。当细胞汇合度为70%左右时，使用Lipofectamine2000转染试剂和100 nmol/L siRNA，敲低VAV1的表达。siRNA序列如下:siRNA-VAV1:5′-GAGCUGUUCUUCAAGAC AA-3′，siNC:5′-UUGUCUUGAAGAACAGCUC-3′。

1.3.2 蛋白免疫印迹分析:使用RIPA裂解液收集并裂解细胞后，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。调匀各样本蛋白浓度后，将等量的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，使用5%脱脂牛奶封闭。经VAV1、SMMHC、SM22α或GAPDH抗体孵育过夜后，同种属第二酶标抗体室温下孵育1 h。使用增强化学发光体系进行免疫印迹分析。

1.3.3 实时荧光定量PCR实验:Trizol裂解细胞后按说明书提取总RNA，用M-MLV反转录酶将RNA反转录为cDNA，荧光定量PCR仪进行RNA定量检测。VAV1引物正向序列：5′-CAACCTGCGTGAGGTC AAC-3′，反向序列：5′-ACCTTGCCAAAATCCTGCA CA-3′；SMMHC引物正向序列：5′-CGCCAAGAGAC TCGTCTGG-3′，反向序列：5′-TCTTTCCCAACCGT GACCTTC-3′；SM22α引物正向序列：5′-AGTGCAG TCCAAAATCGAGAAG-3′，反向序列：5′-CTTGCTC AGAATCACGCCAT-3′；GAPDH引物正向序列：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAA-3′，反向序列：5′-GGCT GTTGTCATACTTCTCATGG-3′。以GAPDH为内参，使用2-△△Ct方法计算VAV1、SMMHC、SM22α的相对RNA表达量。

1.3.4 胶原凝胶收缩实验:按2.5×105个细胞/mL：Ⅰ型胶原(4.42 mg/mL)∶0.1 mol/L NaOH∶2 F-12培养液∶FBS=4∶5∶1∶8∶2的体积比混合，上述混合液接种于12孔板，置于37 ℃孵育1 h以聚合成胶原凝胶。加入含有2% FBS的F-12培养基，使用抹刀将凝胶小心地与培养皿壁分离后，在37 ℃孵箱中培养过夜。相对凝胶面积=现胶原凝胶面积/初始凝胶面积。

1.3.5 EdU染色:使用EdU试剂孵育细胞 2 h后，用4%多聚甲醛固定；用2 mg/mL甘氨酸溶液和0.5% Triton X-100溶液分别处理后， Apollo染色反应液避光孵育30 min；用1 ×Hoechst 33342反应液对细胞核进行染色。使用荧光显微镜观察细胞荧光，计算Apollo/Hoechst阳性率。

1.3.6 动物实验:动物实验经北京大学伦理委员会批准健康科学中心(LA2015017)。8周龄雄性WT(wild type)型及ApoE-/-小鼠给予致动脉粥样硬化的高脂饲料喂养8周。实验结束后，用4%多聚甲醛组织固定液保存主动脉根部和主动脉弓动脉，制备石蜡切片用以免疫荧光染色。

1.3.7 免疫荧光染色:切片置于室温2 h自然晒干后，使用PBS缓冲液中进行水化。5%封闭液室温封闭 1 h后，置于1∶200～1∶000的稀释比例稀释一抗的封闭液中孵育过夜。根据一抗物种的来源加入用封闭液稀释好的荧光二抗室温避光封闭 1 h。使用含有 DAPI的封剂染色 5 min后，荧光显微镜下观察拍照。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 动脉粥样硬化斑块基因表达谱数据

本研究共纳入3个AS数据集。GSE57691中获得4 406个DEGs，上调基因828个，下调基因3 578个；GSE28829中获得1 265个DEGs，上调基因780个，下调基因485个；GSE43292共获得945个DEGs，上调基因551个，下调基因394个(图1A～C)。

A-C.volcano plots and histogram of DEGs in GSE57691，GSE28829 and GSE43292; the X axis indicated the fold-change (logscale) and the Y axis showed the P value (logscale); each symbol represented a different gene; P<0.05, log|fold-change| ≥1

2.2 Hub基因筛选与VAV1鉴定

66个上调基因和86个下调基因在3个数据集中均发生表达变化(图2A)。上述152个DEGs筛选前10个Hub基因分别为VAV1、CD4、ITGAX、CXCL8、ITGAL、IL10RA、TAGAP、NCF4、LCP2、FLNC(图2B)。CTD数据库显示VAV1靶向动脉粥样硬化及其他心血管疾病(图2C)。

2.3 VAV1在动脉粥样硬化斑块中的表达分析

VAV1在GSE57691、GSE28829和GSE43292数据集的AS斑块中均有显著上调(图3A)。免疫荧光染色的结果显示：与WT小鼠相比，VAV1在ApoE-/-小鼠的血管组织表达升高(图3C)。VSMCs标志物SMMHC与VAV1的表达有显著共定位，这提示VSMCs是高表达VAV1的主要细胞(图3B)。

2.4 VAV1抑制血管平滑肌细胞收缩功能

为了进一步证实VAV1在VSMCs中的作用，使用本特异性siRNA降低VSMCs中VAV1的表达水平(图4A,B)。结果表明，敲低VAV1后收缩表型标志蛋白SMMHC和SM22α的表达显著增加(P<0.05)(图4A,B)。通过胶原凝胶收缩实验和EdU染色实验评估VSMCs的收缩能力和增殖能力，结果证实VAV1能够抑制VSMCs的收缩功能，促进其增殖(图4C,D)。

3 讨论

尽管对AS的认识和治疗取得了重大进展，但其病因尚未完全阐明，其临床并发症如心肌梗死、脑卒中和周围血管疾病仍然是全球范围内死亡的主要原因[2,6]。随着测序通量的显著提高和成本的降低，生物信息学分析已被广泛用于探索和识别某些疾病的临床显著生物标志物和潜在靶点。本研究在GEO数据库中获取3组动脉粥样硬化组织测序的数据集，以寻找动脉粥样硬化的潜在生物标志物。根据生物信息学分析可知，在AS斑块中表达显著变化的基因152个。利用DEGs的PPI网络探寻与动脉粥样硬化进展过程中的Hub基因。VAV1作为Hub基因与动脉粥样硬化等心血管疾病进程显著相关，这就提示该指标可作为一个AS的潜在治疗靶点。

A.differentially expressed genes (DEGs) among GSE57691，GSE28829 and GSE43292; B.top ten highly connected genes (Hub genes) of the protein-protein interaction(PPI) network; C.relationship to progression of atherosclerosis related to VAV1 based on the CTD database

A.expression levels of VAV1 in atherosclerosis and normal tissue samples among GSE57691，GSE28829 and GSE43292; B.double immunostaining for SMMHC (smooth muscle cells-marker, green) and VAV1 (red) in WT and apoE-/- mice to identify the major cells for VAV1 secretion; C.relative fluorescence intensity data for VAV1 in WT and apoE-/- mice to identify the VAV1 expression difference(n=6); *P<0.05, **P<0.01 compred with control or WT

A,B.protein and mRNA expression of VAV1, SMMHC and SM22α in smooth muscle cells with transfected VAV1 siRNA; C.representative gel contraction images and the quantification of gel contraction with transfected VAV1 siRNA; D.representative image of EdU incorporation and quantification of EdU-positive cells treated by VAV1 knockdown(scale bar=200 μm); *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with siNC group

通过免疫荧光染色实验可知，VAV1在动脉粥样硬化斑块中表达显著增加。研究表明，VAV1与CD36介导的巨噬细胞转化的泡沫细胞形成有关，其通过cJUN信号通路调控动脉粥样硬化斑块的形成[7]。此外另一篇研究也证实VAV1/RAC1通路影响调节T细胞的细胞骨架和细胞迁移，抑制VAV1可减少AS斑块形成，T细胞促进巨噬细胞向淋巴结迁移，抑制巨噬细胞来源的泡沫细胞的迁移能力[5]。此外研究表明VAV1与SMMHC阳性的细胞有共定位，这提示VAV1主要在血管平滑肌中高表达，然而VAV1在血管平滑肌细胞中的作用还未明确。

VSMCs是血管的重要组成细胞，在正常生理状态下，其主要维持血管的收缩功能[8]然而血管平滑肌细胞具有高度可塑性，当在病理进展过程中能够由收缩表型向多种非收缩表型间转换[9-10]。进一步通过检测收缩蛋白SMMHC和SM22α的表达以及凝胶收缩实验证实，抑制VAV1的表达能够提升VSMCs的收缩能力；EdU染色实验也证实VAV1能够促进VSMCs增殖能力。研究报道证实VAV1是一种信号传导分子，在细胞生长和分化的调控过程中起关键作用，其高表达可以使细胞进入细胞周期，促进细胞增殖[4,11-12]，这与本研究的结果一致。这提示VAV1促进VSMCs异常增殖很可能是其促进AS进展的重要调控通路。

本研究分析发现VAV1是动脉粥样硬化进展过程中重要的调控分子，可能通过抑制VSMCs收缩功能并导致其异常增殖有关，为进一步研究VAV1在AS中的作用机制提供新的线索。