lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155与肝细胞癌预后的关系研究

苏亚勇，林 琳，陈小兰，张惠勇，郭永木

(联勤保障部队第九〇九医院/厦门大学附属东南医院感染科，福建 漳州 363000)

肝细胞癌具有高发病率、高复发率、高侵袭性的特征，在任何年龄段均可发病，尤其以50～70岁人群更常见，男性患病率高于女性[1]。该病早期无典型症状，多数患者在出现典型症状时才就诊，而癌细胞已出现转移，导致预后欠佳，尽早诊断与治疗对降低肝细胞癌的病死率至关重要。既往实验室检查提示，肝细胞癌患者伴有癌抗原125、癌胚抗原、糖类抗原199等水平增高，但这些肿瘤标记物缺乏特异性，在其他疾病(如酒精性肝病、胆管炎等)中也可见增高[2]。因此，临床仍需寻求更理想的指标。近年来，有研究指出微小核糖核酸(microRNAs，miRNA)可通过转录调节相关基因表达，从而发挥抑癌或者促癌作用[3]。赵辉明等[4]发现喉鳞癌组织中miR-155呈高表达。牛连杰等[5]的研究显示乙肝病毒X蛋白能对miR-155进行调控，从而参与肝细胞癌恶性转化过程。这提示miR-155与肿瘤的发生有关，但其对肝细胞癌远期预后的影响尚未完全明确。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可通过募集转录因子对邻近蛋白质编码基因表达进行调节，或者靶向调控转录因子从而调节相关基因表达，参与肿瘤的进展，与患者预后密切相关[6]。研究发现，锌指结构蛋白(zinc finger protein，ZNF)在乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中呈异常表达，可参与肿瘤的发生发展，并且对预后评估有一定价值[7-8]。ZNF385D-AS2作为ZNF中的一员，可能也参与了肿瘤进展，但其与肝细胞癌预后的关系尚不明确，需要临床进一步验证。基于此，本研究拟分析肝细胞癌中lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155预测预后的价值，以期为改善肝细胞癌患者的预后提供思路，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年5月至2019年5月我院收治的肝细胞癌患者156例，其中男89例，女67例；年龄38～72岁，平均(58.42±10.76)岁；肿瘤直径：>5 cm 72例，≤5 cm 84例；肝硬化：有43例，无113例；Child-Pugh分级：A级82例，B级74例；静脉浸润：有40例，无116例；肿瘤数目：单发71例，多发85例；分化程度：低分化53例，中/高分化103例；临床分期：Ⅰ期43例，Ⅱ期51例，Ⅲ期62例。纳入标准：经病理诊断证实为肝细胞癌；年龄≥18岁；术前无新辅助放疗、化疗史；首次确诊为肝细胞癌。排除标准：有肝细胞癌切除禁忌证；合并严重的心血管、脑血管疾病，危及患者生命；合并其他类型的原发性肿瘤；长期使用免疫抑制剂、激素等药物；合并血液系统、免疫系统疾病；出现远处转移。本研究方案获我院伦理委员会批准(2017027)，患者对手术知情同意并自愿签署知情同意书。

1.2 检测方法

所有患者均通过手术取肝细胞癌组织、癌旁组织(距离肝细胞癌病灶至少3 cm)，检测组织中lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155表达水平，在收集组织标本时避开坏死、出血组织，待标本离体后快速置于液氮内，然后存放至-80 ℃环境下。采用实时逆转录PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR，qRT-PCR)检测，逆转录试剂盒、TRIzol试剂、氯仿、Taq DNA聚合酶、异丙醇、异戊醇均购自上海赛默飞世尔科技有限公司；主要仪器包括紫外分光光度计(上海精科实业有限公司，N2型)、高速冷冻机(武汉提沃克科技有限公司，DW-40FL262型)、离心机(山东博科控股集团有限公司，TGL-16M型)、超低温冰箱(山东博科控股集团有限公司，BDF-86V348型)、恒温箱(北京福意联医疗设备有限公司，FYL-YS-150L型)、荧光定量PCR仪(苏州雅睿生物技术有限公司，MA-6000型)。

提取组织总RNA：取组织样本约0.1 g置于冷冻研钵内，加入液氮研磨成细粉，将样本置于离心管内，加入1 mL TRIzol试剂反复吹打，使样本无黏稠感。在室温下放置15 min，加入200 μL氯仿震荡30 s充分混合，静置5 min。在4 ℃下离心15 min(12 000 r/min)，将上清液移至无RNA酶EP管内，加入500 μL异丙醇充分混合，室温下反应10 min，在4 ℃下离心10 min(12 000 r/min)。弃上清液，加入1 mL 75%乙醇轻轻吹打，在4 ℃下离心5 min(7 500 r/min)。弃上清液，倒置行干燥处理5 min。加入20 μL焦碳酸二乙酯水溶解RNA。经紫外分光光度计测定RNA纯度、浓度，存放至-20 ℃下备用。

逆转录与PCR检测：利用逆转录试剂盒使RNA逆转录成cDNA，行PCR扩增，经荧光定量PCR仪测定目的基因表达量。PCR反应条件：95 ℃ 5 min(预变性)，95 ℃ 5 s(变性)，60 ℃ 35 s(退火、延伸)，40个循环。ZNF385D-AS2上、下游序列分别为5’-GGTCTCGGTACATGCGTGGA-3’、5’-TGGCAGTATAACAGGCTCCC-3’。miR-155上、下游序列分别为5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3’、5’-CCCUAUCACGAUUAGCAUUAAUU-3’。GAPDH上、下游序列分别为5’-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’、5’-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’。以2-ΔΔCT计算lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155相对表达量。

1.3 随访

患者术后随访24个月，每隔3个月通过微信、电话等随访1次，在随访期间，患者根据医嘱入院复查，观察肿瘤有无复发，记录随访期间患者的无瘤生存率与累积生存率。记录患者术后24个月的生存情况，根据lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155表达情况分成高表达组与低表达组，并分析二者与临床病理特征的关系。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 肝细胞癌组织、癌旁组织中lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155表达比较

肝细胞癌组织中lncRNA ZNF385D-AS2表达水平低于癌旁组织(P<0.001)，miR-155表达水平高于癌旁组织(P<0.001)，见表1。经Pearson线性相关分析显示，肝细胞癌组织中lncRNA ZNF385D-AS2与miR-155表达呈负相关(r=-0.711，P<0.001)。

表1 肝细胞癌组织、癌旁组织中lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155表达比较

2.2 肝细胞癌组织中lncRNA ZNF385D-AS2表达与临床病理特征的关系

根据肝细胞癌组织中lncRNA ZNF385D-AS2表达均值分组，将其表达水平≥0.25者纳入高表达组，表达水平<0.25者纳入低表达组。lncRNA ZNF385D-AS2低表达组静脉浸润占比(χ2=12.178，P<0.001)、多发性肿瘤占比(χ2=7.634，P=0.006)、低分化占比(χ2=19.868，P<0.001)、临床分期Ⅲ期占比(χ2=9.756，P=0.008)高于lncRNA ZNF385D-AS2高表达组，见表2。

表2 肝细胞癌组织中lncRNA ZNF385D-AS2表达与临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 肝细胞癌组织中miR-155表达与临床病理特征的关系

根据肝细胞癌组织中miR-155表达均值分组，将其表达水平≥8.93者纳入高表达组，表达水平<8.93者纳入低表达组。miR-155高表达组静脉浸润占比(χ2=12.804，P<0.001)、多发性肿瘤占比(χ2=11.766，P=0.001)、低分化占比(χ2=6.417，P=0.011)、临床分期Ⅲ期占比(χ2=11.400，P=0.003)高于miR-155低表达组，见表3。

表3 肝细胞癌组织中miR-155表达与临床病理特征的关系[例(%)]

2.4 lncRNA ZNF385D-AS2、miR-155对肝细胞癌预后的评估价值

lncRNA ZNF385D-AS2高表达组无瘤生存率为90.00%(72/80)，高于lncRNA ZNF385D-AS2低表达组的71.05%(54/76)，差异有统计学意义(Log-rankχ2=9.008，P=0.009);lncRNA ZNF385D-AS2高表达组累积生存率为92.50%(74/80)，高于lncRNA ZNF385D-AS2低表达组的76.32%(58/76)，差异有统计学意义(Log-rankχ2=7.842，P=0.018)，见图1。miR-155高表达组无瘤生存率为73.56%(64/87)，低于miR-155低表达组的89.86%(62/69)，差异有统计学意义(Log-rankχ2=6.576，P=0.020)；miR-155高表达组累积生存率为77.01%(67/87)，低于miR-155低表达组的94.20%(65/69)，差异有统计学意义(Log-rankχ2=8.736，P=0.010)，见图2。

a：无瘤生存曲线；b：累积生存曲线图1 不同lncRNA ZNF385D-AS2表达患者的无瘤生存曲线和累积生存曲线

a：无瘤生存曲线；b：累积生存曲线图2 不同miR-155表达患者的无瘤生存曲线和累积生存曲线

3 讨论

肝细胞癌在全球患病率较高，每年新增病例高达74万人，发病率呈逐年增高趋势[9]。我国每年约有11万人因肝细胞癌死亡，尤其对晚期患者而言，平均生存期仅6个月，未采取任何治疗措施者5年生存率低于3%[10]。目前，外科手术以及放疗、化疗等综合治疗的应用使肝细胞癌的病死率有所下降，但该病复发率、转移率高，易导致预后不良[11]。因此，临床急需寻求预测预后的理想指标，以便及时预测预后不良风险，采取措施降低病死率。

非编码RNA包括lncRNA和miRNA，其在肿瘤发生发展中的作用近年来备受关注[12]。lncRNA是长度大于200个核苷酸的非蛋白质编码转录子，在染色质修饰、转录调节和转录后调节等多方面发挥作用。lncRNA参与了多种肿瘤的发生和发展，与癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡等多种生物学行为有关[6]。lncRNA与miRNA的相互调控关系在肿瘤的发生和发展中扮演着重要角色。lncRNA可以靶向作用于miRNA，进而调控下游靶基因，参与肿瘤的发生和发展[12]。既往研究发现，lncRNA在肿瘤组织中的差异表达对患者预后评估有较高价值[6,13]。

有研究发现,ZNF在多种恶性肿瘤中表现出对肿瘤细胞增殖的调节作用，在宫颈癌、胶质瘤中均可见异常表达，其可能通过调节核因子κB1信号通路抑制肿瘤细胞增殖，这可能是其抑制恶性肿瘤进展的一种机制[14]。ZNF385D-AS2是ZNF的家族成员之一，在肿瘤中的作用报道甚少。miR-155与免疫炎症密切相关，可通过调控炎症反应信号通路，参与肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[15]。在肝细胞癌中，miR-155起到癌基因作用，可能通过SPRK1信号通路[16]、ATG5信号通路[17]等促进肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移。在前期我们用分子生物学信息软件预测到miR-155与ZNF385D-AS2有结合位点，提示ZNF385D-AS2可能通过miR-155参与肝细胞癌的进展。本研究检测了ZNF385D-AS2和miR-155在肝细胞癌组织中的表达，结果显示ZNF385D-AS2表达下调，miR-155表达上调；Pearson线性相关分析显示，ZNF385D-AS2与miR-155表达呈负相关，提示二者可能存在负调控作用。本研究结果还显示，ZNF385D-AS2、miR-155表达均与静脉浸润、肿瘤数目、分化程度、临床分期有关。伴有静脉浸润、肿瘤数目多、分化程度低以及临床分期高的患者肿瘤恶变程度高，更容易出现转移，在这个过程中可能有ZNF385D-AS2、miR-155参与，ZNF385D-AS2表达下调导致其对肿瘤细胞的抑制作用减弱，而miR-155表达上调则能促进肿瘤细胞增殖，二者共同作用导致肿瘤进展。

肿瘤细胞增殖和侵袭是影响肿瘤预后的重要因素[12]，我们推测ZNF385D-AS2和miR-155与肝细胞癌患者的预后密切相关。本研究结果显示，ZNF385D-AS2高表达及miR-155低表达患者的无瘤生存率、累积生存率更高，提示二者可能对预测肝细胞癌患者的预后有一定价值。有学者对肝细胞癌患者进行研究，发现ZNF385D-AS2在肝细胞癌组织中呈低表达，且其表达水平越低，患者的生存率越低[18]，本研究结果与之一致。本研究发现miR-155高表达与患者不良预后有关，结合既往已有研究发现miR-155高表达与非小细胞肺癌患者的不良预后有关[19]，提示miR-155在肿瘤进展中发挥重要作用，可能成为肝癌的治疗靶点之一。

综上所述，肝细胞癌组织中lncRNA ZNF385D-AS2呈低表达，miR-155呈高表达，二者表达可能与静脉浸润、肿瘤数目、分化程度、临床分期相关，且对预后有一定预测价值。本研究局限性为miR-155、lncRNA ZNF385D-AS2作用于肝细胞癌的靶基因尚未完全明确，这也是临床研究的一大难点，日后还有待对此进行更深入研究。