广西沿海红树林土壤放线菌多样性、新颖性及抗菌活性研究

何子邦 李顺莲 吴友浪 陈明胜 庹利

(遵义医科大学基础医学院，遵义 563006)

抗生素的不规范使用甚至滥用，使临床细菌耐药形势严峻，而针对其有效的新型抗生素的研发并没有伴随耐药菌的增加而增加，据美国FDA新药评价中心的数据，近30多年来新批准的抗生素数量逐年减少，甚至到了可能无药可用的地步[1]。因此发现针对耐药细菌的高效新型抗生素已经成为全球亟需解决的问题。抗生素直接或间接来源于药用微生物次级代谢产物，发现包括新物种在内的新药用微生物资源是发现新抗生素的基础，作为药用微生物代表的放线菌，其次级代谢产物丰富，它们独特的结构及优异的生物活性使其成药率极高[2-3]，是发现天然来源新颖结构抗生素的重要资源。

放线菌广泛存在于各种环境中，近年来由于从土壤放线菌发现的新抗生素越来越少，研究者更趋向于特殊环境下微生物资源的挖掘[4]。红树林作为特殊环境的一种，是以红树植物为主要组成部分，还包括其生态下的所有生物群落，该生态系统在涨潮和退潮时受到海水的浸泡，长期处于高盐环境[5-6]。红树林在结构和功能上既不同于海洋生态系统，也不同于陆地生态系统，具有沼泽化、盐渍化、有机质含量高、氧气缺乏等特征[7]。我国红树林主要分布在广东、广西、海南、福建、浙江、香港、澳门、台湾等省区，其中广西是我国红树林的重要分布区，红树林面积占全国的32.7%，位居全国第二[8]。广西红树林集中分布在北部湾广西境内的防城港市、钦州市和北海市等海岸地带。本文对从其中3个主要红树林生态区采集的土壤样品，开展了放线菌多样性、新颖性及潜在放线菌新种的抗菌活性研究，不仅为了解该地区土壤放线菌的分布特点，深入考察广西红树林放线菌资源的多样性和新颖性，同时也期待发现放线菌新物种或活性放线菌，为新抗生素发现储备菌种资源。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 红树林植物根际土壤样品

27份土壤样品于2019年10月采集自3个红树林保护区，包括广西茅尾海红树林自然保护区(15份)、山口红树林自然保护区(7份)、北仑河口红树林自然保护区(5份)。其中20份土壤样品采自7种红树植物根际，包括秋茄、无瓣海桑、桐花树、木榄、白骨壤、红海榄和海漆。样品编号及采集地点等详细信息分别见表1～3。采样时铲除表层土，采样深度为地下20 cm，样品装于灭菌的50 mL离心管中，带回实验室4℃冰箱保存备用。

表1 茅尾海红树林自然保护区土壤样品信息Tab.1 Information of soil samplescollected from Maowei sea Mangrove Nature Reserve

1.1.2 培养基

(1)分离培养基 M1：Marine agar 2216 (BD,Difco)；M2 (改良R2A培养基)：R2A (BD，Difco)，微量盐，复合维生素，1000 mL H2O；M3 (改良高氏一号培养基)：可溶性淀粉20.0 g，葡萄糖1.0 g，NH4NO31.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，胰蛋白胨1.0 g，酵母粉1.0 g，琼脂18.0 g，1000 mL H2O，pH 7.2～7.5；M4(改良ISP 2培养基)：葡萄糖4.0 g，酵母粉4.0 g，麦芽浸粉10.0 g，复合维生素，海盐10.0 g，1000 mL H2O，琼脂18.0 g，pH 7.2～7.5；M5：TSA (BD,Bacto)；M6 (YIM171培养基)：甘油10.0 g，天冬酰胺1.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO30.3 g，复合维生素，微量盐，海盐 20.0 g，1000 mL H2O，琼脂18.0 g，pH 7.2～7.5；M7 (椰子汁-海藻糖培养基(g/L)：示蛋白胨1.0 g，酵母提取物 0.5 g，半胱氨酸1.0 g，海藻糖1.0 g，NaHCO34.0 g，K2HPO40.45 g，KH2PO40.45 g，NaCl 0.9 g，MgSO4.7H2O 0.09 g，CaCl20.09 g，生物素0.01 mg，海盐20.0 g，新鲜椰子汁10 mL，1000 mLH2O，琼脂18.0 g，pH 7.2～7.5；M8: (NH4)2SO42.64 g，KH2PO42.38 g，K2HPO45.65 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，CuSO4·5H2O 0.0064 g，FeSO4·7H2O 0.0011g，MnCl2·4H2O 0.0079 g，ZnSO4·7H2O 0.0015 g，甘油10.0 mL，海盐25.0 g，1000 mL H2O，琼脂18.0 g，pH7.2～7.4。其中复合维生素和微量盐的配方参照先前的研究[9]。

表2 山口红树林自然保护区土壤样品信息Tab.2 Information of soil collected from Shankou Mangrove Nature Reserve

表3 北仑河口红树林土壤样品信息Tab.3 Information of soil collected from Beilun Mangrove Nature Reserve

(2)纯化及斜面培养基 改良ISP2：葡萄糖4.0 g，酵母粉4.0 g，麦芽浸粉10.0 g，海盐10.0 g，1000 mL H2O，琼脂18.0 g，pH 7.2～7.5。

(3)感受态细胞培养基 LB (Solarbio，北京索莱宝科技有限公司)。

1.1.3 抑制剂

抑制剂及其浓度：25 mg/L重铬酸钾，20 mg/L萘啶酮酸，25 mg/L制霉菌素。

1.1.4 试剂和仪器

(1)试剂 pEASY-T1克隆试剂盒及感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)；2×EsTaqMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)；Chelex-100(Bio-Rad 公司)；AxyPrep PCR纯化试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)；X-gal(生工生物工程(上海)股份有限公司)；PCR 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；IPTG、氨苄西林(北京绿泽森公司)；其他试剂均为国产分析纯试剂。

(2)仪器 超净工作台(苏州市金净净化设备科技有限公司)；培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；Centrifuge 5427R小型台式离心机(德国Eppendorf公司)；T100型PCR 扩增仪(美国Bio-Rad公司)；SX-500型高压蒸汽灭菌锅(日本Tomy公司)；ZHWY-211C型震荡摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)；Telstar LYOQUEST冷冻干燥机(西班牙Telstar公司)。

1.1.5 检定菌

革兰染色阳性细菌：金黄色葡萄球菌ATCC43300、金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌12-1、粪肠球菌ATCC33186、粪肠球菌ATCC29212和耻垢分枝杆菌；革兰染色阴性细菌：大肠埃希菌ATCC35218、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、铜绿假单胞菌PA01、铜绿假单胞菌2774、鲍曼不动杆菌ATCC19606和肺炎克雷伯菌；真菌：白念珠菌CCTCC93025和罗伦隐球菌CCTCC91013，均为本实验室保藏菌株。

1.2 方法

1.2.1 土壤样品的处理

称取1 g土样加入到100 mL无菌水中，稀释至10-2g/mL，置烘箱65℃放置5 min，然后置于30℃摇床180 r/min震荡1 h。吸取1 mL浓度为10-2g/mL的土壤悬液至9 mL无菌水中，连续10倍稀释，使最终浓度为10-3g/mL、10-4g/mL，然后各取200 μL分别涂布在M1-M8含有抑制剂的分离培养基上30℃培养1～4周。

1.2.2 菌株的分离和纯化

观察菌落形态，在同一分离平板内根据菌落形态特征去除重复后，挑取单菌落，编好号后采用三区划线法接种在ISP 2固体培养基上进行菌株纯化。

1.2.3 菌株的保藏

(1)甘油保存：配置20% (V/V)的甘油灭菌备用。待纯化的菌株生长好后，挑取适量的菌体于含有1 mL 20% (V/V)甘油作为保护剂的EP管中，-80℃保藏。

(2)牛奶保存：配置15%(W/V)的脱脂牛奶灭菌备用，以每管200 μL分装于安瓿瓶中，瓶口塞上脱脂棉球高压灭菌。待纯化的菌株生长好后，挑取适量的菌体于含有200 μL脱脂牛奶作为保护剂的安瓿瓶中。在-80℃冰箱预冻好后置于冻干机中冻干。酒精喷灯上封口后4℃保藏。

1.2.4 基于16S rRNA基因序列的分子鉴定

(1)采用Chelex-100法[10]提取基因组DNA：配制5%(W/V) Chelex-100溶液，115℃高压灭菌20 min。挑取适量菌体于装有50 μL Chelex-100溶液的EP管中沸水中煮15 min。12000 r/min离心5 min后取上清液作为PCR扩增模板。

(2)目的DNA片段扩增引物为细菌通用引物27F和1492R。50 μLPCR反应体系：2×EsTaqMasterMix 25 μL；27F(10 μmol/L)2 μL；1492R(10 μmol/L)2 μL；模板2 μL；无菌水19 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环；72℃后延伸10 min。产物4℃保存备用。PCR扩增产物送至上海生工(https://www.sangon.com/)进行16S rRNA基因序列测序，测序方法为Sanger法。

1.2.5 潜在放线菌新种16S rRNA基因序列的克隆测序

潜在放线菌新种的16S rRNA基因序列片段扩增产物用AxyPrep PCR纯化试剂盒纯化后，将目的片段与pEASY-T1 Cloning Vector连接，转化Trans-T1感受态细胞。采用含有氨苄西林、X-gal和IPTG的平板进行阳性菌落筛选，从长出的蓝/白色菌落中，挑出单个白色菌落置于含有氨苄西林的LB液体培养基中培养富集后，由生工完成质粒的提取及目的基因片段测序。测序引物为：M13F (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3')和M13R(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')。

1.2.6 基于16S rRNA基因序列的多样性分析和新颖性分析

将菌株16S rRNA基因测序结果提交在线网站EzBioCloud[11]，进行菌株相似性比对搜索，确定菌株的分类学地位。采用MEGA 7.0软件中自带Clustal W软件[12]进行多序列比对，采用MEGA 7.0软件以邻接法进行聚类分析[13-14]，系统进化矩阵根据Kimura-2-parameter模型[15]。重复计算1000次进行自展值分析以评估进化树拓扑结构的稳定性[16]。

1.2.7 潜在放线菌新种的抗菌活性检测及菌株M2SK3-10次级代谢产物潜力分析

(1)挑取适量在固体培养基上生长良好的菌株于含有500 mL ISP 2液体培养基的1 L锥形瓶里，在180 r/min 37℃摇床中震荡培养培养7～14 d。发酵液经5000 r/min离心5 min去除菌体，上清液用等量的乙酸乙酯萃取2次。用旋转蒸发仪浓缩后，用4 mL甲醇溶解即为乙酸乙酯粗提物。

(2)将甘油保存的检定菌株接种在LB培养基上活化，挑取活化好的检定菌于含有7 mL LB液体培养基的15 mL离心管中，在180 r/min 37℃摇床中震荡培养12～48 h。配制LB固体培养基，待培养基温度为55℃左右时以0.1%的接种量加入检定菌悬液，倾注平板备用。

(3)将直径为6 mm的无菌滤纸片放于无菌空白平皿中，吸取40 μL乙酸乙酯粗提物滴加在滤纸片上，挥干甲醇后，将滤纸片贴在含有检定菌的培养基上，37℃培养24～48 h后观察抑菌圈的有无和大小。

(4)收集菌株M2SK3-10菌体，干冰条件寄送至北京诺禾致源科技股份有限公司完成基因组的提取、测序、组装和注释。使用antiSMASH在线平台(https://antismash.secondarymetabolites.org/)对菌株M2SK3-10次级代谢产物生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster,BGC)进行预测分析，评价菌株合成次级代谢产物的潜力。

2 结果与分析

2.1 红树林土壤放线菌分离结果

从3个红树林生态区中共分离菌株246株，其中放线菌181株。茅尾海红树林自然保护区分离出放线菌102株、山口红树林自然保护区分离出放线菌71株、北仑河口分离出放线菌8株。分离培养基中，M1培养基出菌数及多样性均最高，出菌数为45株。短杆菌属(Brevibacterium)、潮湿居菌属(Humibacillus)、Mumia属、栖白蚁菌属(Isoptericola)为M1培养基所分离，诺尔土菌属(Knoellia)和雷夫松菌属(Leifsonia)为M4培养基所分离，珊瑚放线菌属(Actinocorallia)为M6培养基所分离(表4)。综合种属数目，分离效果较好的培养基依次为M1、M4、M2、M5、M6、M8、M3和M7。

2.2 红树林土壤放线菌多样性分析

3个红树林生态区分离得到的放线菌分布于6 个目12个科19个属，结果如表5和图1所示，包括中国单胞菌属(Sinomonas)、短小杆菌属(Curtobacterium)、诺卡菌属(Nocardia)、壤霉菌属(Agromyces)、链霉菌属(Streptomyces)、雷夫松菌属(Leifsonia)、红球菌属(Rhodococcus)、小单胞菌属(Micromonospora)、栖白蚁菌属(Isoptericola)、诺尔土菌属(Knoellia)、分枝杆菌属(Mycolicibacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、微球菌属(Micrococcus)、间孢囊菌属(Intrasporangium)、类诺卡菌属(Nocardioides)、小双孢菌属(Microbispora)、珊瑚放线菌属(Actinocorallia)、潮湿居菌属(Humibacillus)、Mumia属。其中红球菌属(Rhodococcus)和链霉菌属(Streptomyces)各分离出47株，占放线菌属的26.0%，为优势菌属。其次是小单胞菌属(Micromonospora)分离出38株，占放线菌属的21.0%。如图2所示，从茅尾海红树林自然保护区土壤中分离到的放线菌分布在16个属中，包括中国单胞菌属(Sinomonas)、短小杆菌属(Curtobacterium)、诺卡菌属(Nocardia)、壤霉菌属(Agromyces)、链霉菌属(Streptomyces)、雷夫松菌属(Leifsonia)、红球菌属(Rhodococcus)、小单胞菌属(Micromonospora)、栖白蚁菌属(Isoptericola)、分枝杆菌属(Mycolicibacterium)、微球菌属(Micrococcus)、间孢囊菌属(Intrasporangium)、类诺卡菌属(Nocardioides)、小双孢菌属(Microbispora)、潮湿居菌属(Humibacillus)、Mumia。分离出放线菌属最多的是编号为QZ16的海漆根际土壤(12个属)，其次是编号为QZ11的桐花树根际土壤(5个属)，QZ15的无瓣海桑根际土壤(4个属)，QZ6的秋茄根际土壤(3个属)。QZ1、QZ8、QZ9、QZ12、QZ13、QZ14等6份土壤样品未分离到放线菌，原因是分离平板被细菌或真菌严重污染。从山口红树林自然保护区土壤中分离到的放线菌分布在8个属中，包括诺卡菌属(Nocardia)、壤霉菌属(Agromyces)、链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属(Rhodococcus)、小单胞菌属(Micromonospora)、分枝杆菌属(Mycolicibacterium)、诺尔土菌属(Knoellia)、珊瑚放线菌属(Actinocorallia)。如图3所示，分离出放线菌属最多的是编号为SK3的白骨壤根际土壤，分离到7个属，其次是编号为SK4的秋茄根际土壤，分离到6个属。北仑河口地区土壤中分离出放线菌属较少，仅编号为BK2的非植物根际土壤、BK3的秋茄根际土壤、BK4和BK5的非植物根际土壤分别分离到1个属，见图4，原因是分离平板被细菌或真菌污染，影响了放线菌出菌率。

图1 基于邻接法构建的16S rRNA基因部分序列进化树Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on partial sequences of 16S rRNA gene

图2 茅尾海红树林自然保护区土壤放线菌多样性Fig.2 Diversity of actinobacteria isolated from mangrove soil in Maowei sea Mangrove Nature Reserve

图3 山口红树林自然保护区土壤放线菌多样性Fig.3 Diversity of actinobacteria isolated from mangrove soil in Shankou Mangrove Nature Reserve

图4 北仑河口红树林土壤放线菌多样性Fig.4 Diversity of actinobacteria from mangrove soil in Beilun Estuary Mangrove Forest

表5 181株红树林土壤放线菌的多样性分布Tab.5 Diversity and distribution of 181 actinobacterial strains

2.3 红树林土壤放线菌新颖性分析

根据放线菌16S rRNA基因序列相似率小于98.65%的菌株属于不同物种的归类原则[17]，对广西沿海红树林土壤可培养放线菌进行新颖性分析发现，分离获得的放线菌中，16S rRNA基因序列相似率低于98.65%的菌株共有4株(表6)，对这4株菌进行16S rRNA基因序列克隆测序，发现菌株M2SK6-2、M2SK3-10、M5SK3-12和M1QZ16-11分别与最近有效种Streptomyces avicenniaeDSM 41943T、Rhodococcus oleiJCM 32205T、Agromyces kandeliaeQ22T和Humibacillus xanthopallidusKV-663T的16S rRNA基因序列相似性最高，相似率分别为97.4%、97.7%、98.4%和98.4%。在基于16S rRNA基因序列构建的Neighbour-Joining系统发育树中，菌株M5SK3-12与Streptomyces属中菌株聚为一簇并形成稳定的分支(图5)，菌株M2SK3-10与Rhodococcus属菌株形成单一分支(图6)，菌株M5SK3-12与Agromyces属中菌株形成稳定的分支(图7)。M1QZ16-11与Humibacillus xanthopallidusKV-663T形成单一分支(图8)。基于相似率和进化树分析，推测菌株M2SK6-2、M5SK3-12、M2SK3-10、M1QZ16-11是潜在放线菌新种。4个潜在放线菌新种中，3个是从山口红树林保护区分离得到，1个是从茅尾海红树林自然保护区分离得到，未从北仑河口红树林中分离出新物种，具体见表6。

图5 基于邻接法构建的菌株M2SK6-2的16S rRNA基因序列进化树Fig.5 Neighbour-Joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain M2SK6-2

图6 基于邻接法构建的菌株M2SK3-10的16S rRNA基因序列进化树Fig.6 Neighbour-Joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain M2SK3-10

图7 基于邻接法构建的菌株M5SK3-12的16S rRNA基因序列进化树Fig.7 Neighbour-Joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain M5SK3-12

表6 16S rRNA基因序列相似率小于98.65%的4株放线菌Tab.6 The 4 actinobacterial strains that 16S rRNA gene sequence similarities less than 98.65%

2.4 4株潜在放线菌新种的抗菌活性及菌株M2SK3-10次级代谢产物合成潜力分析

对4株放线菌潜在新种的抗菌活性测定结果表明，仅菌株M2SK6-2具有抗菌活性，其发酵液乙酸乙酯萃取物对耻垢分枝杆菌、金黄色葡萄球菌临床菌株12-1、金黄色葡萄球菌ATCC43300、金黄色葡萄球菌ATCC29213的抗菌效果如图9所示。使用antiSMASH对菌株M2SK6-2合成次级代谢产物的潜力的预测分析将另文报道。

图9 菌株M2SK6-2抗菌活性结果Fig.9 The antibacterial activities of strain M2SK6-2

菌株M2SK3-10是稀有放线菌红球菌属的潜在新种，使用antiSMASH对菌株M2SK3-10合成次级代谢产物的潜力进行预测分析，其次级代谢产物生物合成基因簇共有14个(表7)，主要包含非核糖体多肽类(NRPS、NRPS-like)、萜烯类(terpene)、非α-多聚氨基酸类(NAPAA)等基因簇。其他未匹配到同源基因簇的序列，包含氧化还原因子(redox-cofactors)、萜烯类(terpene)、核糖体合成和翻译后修饰肽(RiPP-like)、聚酮类(T1PKS)和非核糖体多肽类(NRPS)和非α-多聚氨基酸类(NAPAA)基因簇，菌株M2SK3-10具有潜在产生如atratumycin或neomycin等抗菌次级代谢产物的能力。

表7 M2SK3-10次级代谢产物生物合成基因簇Tab.7 Secondary metabolite biosynthesis gene clusters of strain M2SK3-10

3 结论和讨论

广西是我国重要的红树林分布区，有独特的岛群红树林，全国连片面积最大的天然红海榄林以及我国面积最大的城市红树林和沙生红树林，广西北部湾已发现海洋细菌1843种，隶属于5门30目59科120属，在属水平上，以放线菌中的链霉菌属、微杆菌属和壤霉菌属为优势属[18]。

本文通过综合各研究人员所用培养基营养成分，设计了8种分离培养基，从广西北部湾3个主要红树林生态区(茅尾海红树林保护区、山口红树林保护区、北仑河口红树林)的27份土壤样品中共分离出放线菌181株，其中茅尾海红树林自然保护区分离出放线菌102株、山口红树林自然保护区分离出放线菌71株、北仑河口分离出放线菌8株。这些放线菌分布于6个目12个科19个属，其中链霉菌(26.0%)和红球菌(26.0%)为优势菌属，除了优势菌属红球菌属和链霉菌属外，本研究还分离到中国单胞菌属、短小杆菌属、诺卡菌属、壤霉菌属、雷夫松菌属、小单胞菌属、栖白蚁菌属、诺尔土菌属、分支杆菌属、短杆菌属、微球菌属、间孢囊菌属、类诺卡菌属、小双孢菌属、珊瑚放线菌属、潮湿居菌属、Mumia属等稀有放线菌属。另外，还分离到4个潜在放线菌新种，16S rRNA基因初步识别菌株M1QZ16-11为潮湿居菌属潜在新种(＜98.4%)，该属目前仅有一个有效种H.xanthopallidus被原核微生物标准命名网站(LPSN)收录。潮湿居菌属首次被Kageyama描述[22]，是从稻田土壤和湖底沉积物分离而来，目前还未有对红树林土壤来源地潮湿居菌属新物种的描述。

本研究发现一株与Streptomyces avicenniaeDSM 41943T有较高16S rRNA基因序列相似率(97.4%)的链霉菌潜在新种M2SK6-2，对金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药株(MRSA)、金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感株和临床分离的金黄色葡萄球菌及耻垢分枝杆菌均具有较强的抑制活性，而同样分离自红树林植物根际土壤的S.avicenniaeDSM 41943T却没有抑菌活性方面的报道[23]。菌株M2SK6-2可能是抗MRSA及结核分枝杆菌活性化合物的来源。从红树林土壤分离的另一红球菌属潜在新菌M2SK3-10与Rhodococcus oleiJCM 32205T的16S rRNA基因序列相似率较高，为97.7%。有研究报道R.oleiJCM 32205T具有降解石油的能力[24]，故菌株M2SK3-10降解多环芳烃化合物的活性有待进一步探究。另外，在菌株M2SK3-10基因组中预测到14个次级代谢产物生物合成基因簇，表明该菌株具有潜在产生如atratumycin或neomycin等抗菌次级代谢产物的能力，但抗菌活性检测表明，菌株M2SK3-10的ISP2培养液的乙酸乙酯萃取物没有抗菌活性，因此，后续拟通过共培养或采用多种不同培养基发酵的OSMAC (一菌多产物)策略，开展菌株M2SK3-10潜在次级代谢产物生物合成基因簇激活的研究。

综上所述，广西沿海红树林土壤放线菌具有丰富的物种多样性和较高的新颖性，本研究获得的菌株为后期进一步开发利用广西红树林药用放线菌资源奠定了基础。