流式细胞术检测精子线粒体膜电位影响因素分析*

李智新 沈嘉铭 徐 健 颜宏利** 李维杰

1.上海理工大学生物系统热科学研究所（上海 200093）；2.中国人民解放军海军军医大学第一附属医院（上海 200433）

线粒体是精子细胞内能量转换和新陈代谢的关键部位，参与精子超激活运动、获能、顶体反应、调节钙稳态、调控细胞凋亡等多种生理过程[1，2]。线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）反映出线粒体内三羧酸循环的情况，是衡量其能量状态的指标[3]。精子MMP与其活力密切相关[4]，此外，MMP似乎与精子受精能力呈正相关，与DNA碎片呈负相关[5]。因此，检测精子MMP对评估男性生育能力以及精子发生的病理生理学研究具有重要意义。

目前，广泛使用商业化荧光探针如：JC-1（C25H27CL4IN4）检测MMP[6]，基本流程为：取一定量待测精液样本与JC-1单标试剂混匀，在37℃的CO2培养箱中避光孵育10分钟后，将样本上流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，应用荧光通道FL1（绿）和FL2（红）检测荧光强度，红色/绿色荧光强度比例降低代表线粒体去极化。由于在临床工作中实验室经常将样本集中起来一起检测，那精液样本放置时间和JC-1染色时间对精子MMP的结果有怎样的影响？精液冷藏以及添加样本保护剂能否降低时间对精子MMP的影响？相关研究极少。为此，本课题组对此进行了初步探讨，现报道如下。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

精子尾部中段染色试剂盒由浙江星博生物科技股份有限公司提供，葡萄糖、甘氨酸、HEPES等均购自Sigma公司（Sigma,America），精子冷冻保护液1067购于ORIGIO公司，所用仪器为BD Accuri C6流式细胞仪。检测精子MMP时，进样速度为低速，14μL/min，样本流直径10μm；采样停止条件为采集精子数5000个；免调电压；前向散射光（FSC）荧光强度阈值＞105。

二、样本保护剂配置

称取35.6 mg氯化钾、29.4 mg硫酸镁、16.2 mg磷酸二氢钾、1 g葡萄糖、1 g甘氨酸、25 mg二水氯化钙、476 mg HEPES、210 mg碳酸氢钠、500 mg血清白蛋白、10 mg维生素C和维生素B12，用灭菌超纯水定容至100 mL，调整pH为7.2，然后用0.22μm滤器过滤后置于4℃冰箱保存备用。

三、精液样本来源

精液样本来自长海医院生殖中心门诊，经精液常规分析后剩余样本。所有研究对象均禁欲2～7 d，手淫法留取标本于无菌取精杯中。

四、精子MMP检测

（一）检测原理

JC-1是一种亲脂性阳离子荧光染料，在细胞内以聚合物和单体两种不同形式存在。JC-1会在具有高MMP的线粒体中聚集形成聚合物，经488 nm激光激发后产生橙红色荧光；而在低MMP的线粒体中形成单体时，JC-1经488 nm激光激发后产生绿色荧光，通过流式细胞仪捕捉的红色和绿色荧光数目，发橙红色荧光精子百分率即为精子MMP。

（二）检测方法

按“精子尾部中段染色试剂盒”说明书操作，即每个样本准备对照管和检测管，分别在其中加5μL精液和20μL试剂A（样本缓冲液），混匀后，将对照管置于85℃金刚浴中静置2min，利用高温使其线粒体失活，之后在室温下向两管中分别加入480μL A液、5μL B液（JC-1染色液)，震荡混匀，置于37℃水浴箱避光孵育15 min后上机检测。其中对照管为阳性对照组，结果分析中根据阳性对照组的双参数散点图中的阳性信号来设门。采用MMPView软件进行数据分析。

五、精子MMP流式细胞术检测的重复性分析

取MMP高、中、低各1例精液样本，以上述方法重复检测10次，计算变异系数（CV）以反映精子MMP流式细胞术检测的重复性[7]。

六、样本放置时间及温度对精子MMP检测的影响

随机收集11例精液样本，分别于留取标本当日，精液放置室温下30 min液化后取出1000μL，在检验完MMP后，平均分为两份，分别放置在室温和2～8℃下冷藏，2 h、4 h、8 h之后，按上述方法进行精子MMP检测。

七、样本保护剂对精子MMP检测的影响

随机收集9例精液样本，精液完全液化并摇匀后，每份样本各吸取1000μL，平均分为两组：对照组（无保护剂添加）、实验组（1：1添加保护剂）。之后避光冷藏于2～8℃，待2、4、8 h后取出，按“精子尾部中段染色试剂盒”说明书进行精子MMP检测。

八、精液样本冷冻对精子MMP检测的影响

随机收集5例精液样本，平均分为两组：对照组和实验组，实验组按1：1缓慢添加精子冷冻保护剂。之后将两组都放于-20℃冷冻，1 d后取出，在37℃水浴中摇晃复温后，按“精子尾部中段染色试剂盒”说明书进行精子MMP检测。

九、统计学分析

本研究数据采用SPSS Version20（IBM公司）统计软件分析。各组数据先进行正态分布分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示。不同组间比较进行配对t检验，P＜0.05为统计学分析具有显著性差异。

结 果

一、精子MMP流式细胞术检测的重复性评价

高、中、低MMP的精液样本使用流式细胞术重复检测10次，所得CV均低于7%（表1），提示精子MMP流式细胞术检测的重复性较好。JC-1流式细胞术检测结果代表性示意图见图1。

表1 精子MMP流式细胞术检测的重复性评价（±s）

表1 精子MMP流式细胞术检测的重复性评价（±s）

Sample n MMP（%） CV（%）高10 65.90±3.25 4.93中10 41.27±2.63 6.37低10 23.29±1.05 4.51

图1 精子MMP流式细胞图

二、样本放置时间及温度对精子MMP检测的影响

精液样本在室温和2～8℃分别放置30 min、2 h、4 h、8 h后精子MMP检测结果见表2。结果显示样本随存放时间的增加，精子MMP呈显著下降。与放置30 min相比，样本放置2 h后MMP显著降低（P＜0.05），4 h、8 h后降低更为明显。精液样本于2～8℃冷藏2、4、8 h后，精子MMP随冷藏时间延长而下降，而与室温下放置对应时长的样品相比，MMP下降变缓，但无显著差异（P＞0.05）。

表2 不同放置时间及温度下的精子MMP结果比较(±s)

表2 不同放置时间及温度下的精子MMP结果比较(±s)

注：与30 min相比，*P＜0.05；与室温下2 h相比，#P＜0.05

Placement time and temperature n MMP（%）30 min 11 43.31±15.96室温下2 h 11 35.44±17.23*室温下4 h 11 28.74±18.10*#室温下8 h 11 22.02±20.62*#冷藏2 h 11 36.20±15.01*冷藏4 h 11 30.46±18.94*#冷藏8 h 11 20.13±19.55*#

三、样本保护剂对精子MMP检测的影响

精液样品加入保护剂后放置于2～8℃下2、4、8 h后的精子MMP结果见表3。结果显示，与对照组相比，实验组于2～8℃冷藏2、4、8 h后，精子MMP下降减缓，在2 h内MMP不存在显著变化，但超过4 h后，MMP则会显著下降（P＜0.05）。

表3 样品保护剂对精子MMP的影响（n=9）

四、精液样本冷冻对精子MMP检测的影响

添加冷冻保护剂的精液样本在-20℃冷冻1 d后的精子MMP结果见表4。结果显示，样本冷冻在-20℃下，即使添加了冷冻保护剂，但复温后的精子MMP与冷冻前仍存有显著差异（P＜0.01），说明无法将冷冻后的精子MMP作为室内质控品。

表4 精液样本冷冻后精子MMP结果比较（±s）

表4 精液样本冷冻后精子MMP结果比较（±s）

注：实验组为添加样本保护剂，对照组则无；组内与冷冻前相比，*P＜0.01

Sample n 冷冻前 冷冻后实验组 5 38.32±11.94 16.23±8.04*对照组 5 39.57±13.25 4.87±2.69

讨 论

精子MMP与精子活力、受精潜能及形态均密切相关，可以作为临床评估特发性男性不育的重要指标，在本质上为男性不育的诊断提供重要依据，故准确检测精子MMP对了解男性生育能力、男性生殖和辅助生殖的基础研究及临床研究的可靠性有重要意义[8，9]。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针，与其它阳离子染料如罗丹明123相比特异性更高，红绿色荧光强度比率只受线粒体膜电位变化的影响，不受线粒体差异的干扰，基于JC-1染色联合流式细胞术很适合用于临床常规的精子MMP测试。在临床应用中要对精液样本的MMP进行客观测量，实现标准化方案至关重要。首先我们证实了该方案具有较好的重复性，不论样本MMP值的高低，CV值均低于7%。其次要确定在流式细胞仪检测前样本放置条件对MMP结果的影响，样品放置不当可能会严重改变精子的MMP。

我们观察到随着放置时间的延长，精子MMP有显著下降，特别是在超过2小时以后，虽然其中有部分样本的变化较小，但在临床检验中还是要在液化后30～60 min内完成检验，保证检验结果的准确性。这种变化差异可能与病人之间的个体差异以及样本本身质量有关[10]，在实验中我们还观察了染色时间对精子MMP结果的影响，对于染色时间或染色后放置时间的延长，在40 min内精子MMP的结果不会有显著变化，提示JC-1染色后检验技术人员可在相对空闲的时间里进行流式细胞术分析。但需注意的是，反应液应避光放置，且在上流式细胞仪检测之前应再次充分混匀，否则对检测结果可能有显著影响，推测与精子下沉导致采集精子数量显著下降有关。

为了延缓MMP的变化，我们测试了冷藏及保护剂对样本的影响，结果显示在2～8℃冷藏的精液样本MMP下降速度略低于室温放置的样本，但没有显著差异，甚至部分样品在4℃下MMP下降更快。这可能由于在4℃下精子的代谢能力和活动强度随着温度的下降而减弱，呈现出休眠状态，但部分样本精子膜稳定性较差，当温度变化过快时，会对其造成冷应激，致使精子活力下降[11]。当样本添加保护剂后于4℃下保存，精子MMP下降相对减缓，表明保护剂可以在一定程度下短暂的维持精子质量，但是超过2 h后精子MMP仍有显著降低。这种短暂的延缓作用可能与以下原因相关，保护剂中的白蛋白可以通过与精子质膜磷脂相互作用以降低精子受损程度[12，13]，同时诱导精子蛋白磷酸化，从而维持线粒体膜电位[14，15]。保护剂中的外源葡萄糖为精子代谢提供底物，维持精子活力[16]。其次保护剂中的抗氧化剂可以降低精子细胞内的ROS水平，增加细胞的抗氧化能力，进而保护精子细胞的线粒体[17，18]。但随着时间的延长，精子凋亡水平提高，ROS生成增多，精子蛋白脱磷酸化趋势逐渐增强，致使精子线粒体受损，使精子MMP呈现显著的下降趋势。

为了做好精子MMP室内质控，本研究意图使用冷冻精液样本作为质控品，但结果显示不论是否添加精子冷冻保护剂，精液样本冻融后，精子MMP都有显著下降。这可能是由于冻融过程中冰晶和渗透压的快速变化，导致线粒体膜流动性改变，致使线粒体膜电位下降[19]。这意味着冷冻后的精液样本无法作为室内质控品。对精子MMP检测的流式细胞术如何进行质控，以及如何确保不同流式细胞仪检测结果之间的一致性，是未来要解决的关键问题。