水引发对甜菜种子萌发以及生理特性的影响

刘朝阳，胡华兵，王荣华，刘乃新，王茂芊

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2石河子农业科学研究院，新疆石河子 832000）

0 引言

甜菜是除甘蔗外中国重要的糖料作物之一，由于甜菜种子自身萌发缓慢，抗逆性较弱，难以满足苗齐、苗匀、苗壮的需求，如何快速提高甜菜的发芽率、田间出苗率，提高甜菜的产量是亟待解决的问题[1-2]。为了获得高而稳定的产量，甜菜种子必须具有一定的抗性[3]。因此种子引发具有加速发芽、提高抗逆性、打破种子休眠的效果，能够使种子自身代谢提高、活力增强、出苗整齐和改善营养状况[4-6]。影响种子引发效果的因素多种多样，引发方法、引发剂、时间、温度等均对引发效果有影响，它们之间既相互作用又会相互影响[7]。水引发具有廉价、简捷、安全环保和易推广的优势，是促进萌发但并不引起伤害的浸种技术[8-9]。如罗金梅等[10]为了探讨打破豇豆种子休眠的处理途径进行豇豆种子水引发研究，结果表明新收获的豇豆种子在20℃引发12 h能够满足生产需求。周红涛等[11]研究发现，以水引发技术为基础的“两段浸种法”明显提高了早稻种子杀菌剂抑制生长作用的抗性。江绪文等[12]在水引发处理对菠菜种子萌发及活力的影响研究中发现，不同大小等级菠菜种子通过适宜的水引发、保湿时间种子的活力得到提高。刘华荣等[13]研究水引发对百喜草萌发与幼苗生长的影响，结果表明35℃48 h的引发组合更加适于百喜草。由于国内甜菜种子引发起步较晚，甜菜种子水引发的研究鲜有报道[14-15]。本研究以蒸馏水为引发剂，设置不同的温度以及不同的预浸种时间组合，对甜菜种子进行9个不同温度、预浸种的处理，研究在水引发下先在常温下预浸种时间10、20、30 min，然后在10℃相对湿度100%的环境中保湿24 h对甜菜种子萌发特性以及生理特性的影响，以期为甜菜种子引发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2021年5—9月在黑龙江大学现代农业与生态环境学院甜菜遗传育种重点实验室进行。

1.2 试验材料

供试材料选用甜菜单粒种TD802，由黑龙江大学现代农业与生态环境学院的甜菜优良品种选育团队提供。

1.3 试验方法

研究采用的引发剂为蒸馏水，共设置有9个处理（表1）。甜菜种子先在蒸馏水中分别预浸种10、20、30 min，然后分别在10、20、30℃相对湿度100%的环境中保湿24 h，9个处理试验的对照均为TD802干种子。浸泡结束后用蒸馏水快速清洗3～4次，用滤纸吸附干净表面的浮水，置于25℃的鼓风干燥箱中24 h，在此期间待种子与浸种前质量一致时，再取出备用。

表1 蒸馏水的不同预浸种时间和处理温度组合的9个处理

1.3.1 甜菜种子发芽试验及电导率测定 本研究的引发处理试验在黑龙江大学现代农业与生态环境学院的甜菜品质监督检验测试中心进行。采用蒸馏水和次氯酸钠将发芽盒清洗干净、消毒、晾干，将灭过菌的发芽纸平铺在晾干的发芽盒中，每个纸格放2粒种子，种子均匀摆开后，将33 mL蒸馏水均匀喷进盒子里。每个处理3次重复，温度设置为23℃。每天检测发芽种子数，调查发芽势和发芽率，测量胚根及肧轴总长度，计算发芽指数、活力指数以及临界阈值[式(1)～(4)]。利用Excel软件数据分析和作图。

挑选已引发处理和未引发的50粒颗粒饱满的种子，以未引发的种子为对照，每个处理重复3次。放入洁净的250 mL的烧杯中，加入200 mL蒸馏水，以未浸泡任何种子的蒸馏水为空白，用保鲜封口。于24℃室温条件下浸泡24 h，用电导率仪测定溶液电导率，用400～600 mL的蒸馏水作为冲洗水，冲洗电导仪2次，用滤纸吸干。再将种子及浸泡液于沸水浴中煮10 min，冷却至室温后摇匀再次测定绝对电导率，并计算出相对电导率，如式(5)。

1.3.2 甜菜幼苗形态生理指标的测定 采用硫代巴比妥酸(TBA)的方法测定丙二醛含量；SOD活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)还原法；用愈创木分法测定POD活性；采用紫外吸收法测定CAT活性。

2 结果与分析

2.1 不同温度、预浸种时间萌发特性的处理结果

2.1.1 10℃不同预浸种时间引发组合的处理结果 表2结果显示，处理1、2、3的发芽率和发芽指数分别为88.67%、88.33%、90%和32、32.9、34.43，均高于对照，与对照相比发芽率及发芽指数分别高出了3.67、3.33、5个百分点和5.56、6.46、7.99。临界阈值是对种子发芽率以及发芽指数的综合评价，其值越大越能说明该种子引发效果好。根据上述发芽率以及发芽指数可得，处理1、2、3的临界阈值均高于对照，其中处理3的临界阈值最高达到了17.66，处理1和2分别为16.44、16.89，相比对照(13.64)分别高出了4.02、2.8、3.25。发芽势分别为88%、85.67%、88.67%，均高于对照，分别高出了5、2.67、5.67个百分点。由活力指数结果可见，3个同一温度不同预浸种组合处理的活力指数分别相较于对照高出1.69、1.6、1.49倍，分别为276.63、263、245.18。试验结果显示，在10℃不同预浸种时间组合处理甜菜种子时，其发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、临界阈值均明显高于对照，其中处理1的活力指数最高，处理3的临界阈值最高。表明这3种组合处理可以有效激发种子活力，促进种子生长。

表2 10℃不同预浸种时间组合处理甜菜种子萌发调查表

2.1.2 20℃不同预浸种时间引发组合的处理结果 表3结果显示，处理4和6的发芽率相同均为86.33%，处理5的发芽率则为89.67%，而处理4、5、6的发芽指数分别为38.78、41.89、39.71，均高于对照，与对照相比发芽率及发芽指数分别高出了1.33、4.67、1.33个百分点和12.34、15.45、13.27。处理4、5、6的临界阈值均是高于对照，其中处理5的临界阈值最高达到了21.39，处理4和6分别为19.82、20.29，相比对照分别高出了7.75、6.18、6.65。发芽势分别为85%、89.33%、86%，分别高出对照2、6.33、3个百分点。由活力指数结果可见，3个同一温度不同预浸种组合处理的活力指数分别较对照高出 2.49、2.44、2.73 倍 ，分别为 408.78、400.21、447.4。试验结果显示，在20℃不同预浸种时间组合处理甜菜种子时，其发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、临界阈值均明显高于对照，其中处理5的临界阈值最高，引发效果好于其他2组处理，但是在常温下预浸种30 min，然后在20℃保湿24 h的活力指数最高。表明处理6相较于其他2组更能激发种子自身活力。

表3 20℃不同预浸种时间组合处理甜菜种子萌发调查表

2.1.3 30℃不同预浸种时间引发组合的处理结果 表4结果显示，处理7、8、9的发芽率和发芽指数分别为89%、86%、91%和32.4、35.61、36.35，均高于对照，与对照相比分别高出了4、1、6个百分点和5.69、9.17、9.91。根据上述发芽率以及发芽指数可得出，处理7、8、9的临界阈值均高于对照，分别为16.65、18.24、18.63，较对照分别高出了3.01、4.6、4.99。发芽势分别为87.33%、85%、90.67%，分别高出对照4.33、2、7.67个百分点。由活力指数结果可见，3个同一温度不同预浸种组合处理的活力指数分别较对照高出2.13、2.63、2.51倍，分别为349.8、431.12、411.29。试验结果显示，在30℃不同预浸种时间组合处理甜菜种子时，其发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、临界阈值都明显高于对照，其中处理8的活力指数明显高于其他2组，临界阈值低于处理9，但是差异并不是很明显。表明在常温下预浸种20 min，然后在30℃保湿24 h的处理，能够更好地使种子生长。

表4 30℃不同预浸种时间组合处理甜菜种子萌发调查表

2.1.4 不同温度、预浸种时间引发组合的电导率处理结果 图1结果显示，9个不同引发组合相对电导率均高于对照且差异显著(P＜0.05)，其中处理1、2、8，处理3、7，以及处理5、6、9的相对电导率分别相同，分别为95.33%、96%、94%。在10、20℃，随着预浸种时间的增加呈增长趋势，30℃与之相反，呈缓慢下降趋势。结果表明，处理3和处理7能够最大限度、最快速地修复、重建细胞膜，使种子损伤达到最小且渗出物最少。处理4细胞的损伤较为严重。

图1 不同引发组合相对电导率处理结果

不同组合活力指数和电导率比对结果如图2所示。9个不同引发组合的活力指数均高于对照且差异显著(P＜0.05)，浸出液电导率均低于对照且不同温度间差异显著(P＜0.05)。在10℃时，随着预浸种时间的增加，活力指数呈缓慢下降的趋势，浸出液电导率无明显差异，相较于对照降低了28.01%、27.44%、30.21%。在20℃时，随着预浸种时间的增加，浸出液电导率虽然无显著差异，却呈缓慢下降的趋势，比对照降低了40.38%、37.55%、36.02%。在30℃时，活力指数随着预浸种时间的增加呈现先上升再下降的趋势，浸出液电导率呈现先下降再上升的趋势，相比对照而言，分别降低了52.04%、51.45%、55.52%。根据活力指数以及电导率，在10℃时，除处理2浸出液电导率外处理1活力指数最高，浸出液电导率较低，因此处理1为10℃的最佳组合处理。在20℃和30℃时，处理6和处理8的活力指数最高，浸出液电导率最低，为20℃和30℃的最佳组合处理。经过筛选处理1、6、8为最佳组合进行后期的生理指标测定。

图2 不同组合活力指数和浸出液电导率比对

2.2 不同温度、预浸种时间生理特性的处理结果

2.2.1 丙二醛 根图3结果显示，对照与处理1差异不显著，但却与处理6和处理8的差异显著(P＜0.05)。处理1、8相比对照上升了0.06、1.84 μmol/g，处理6相比对照下降了1.25 μmol/g。随着浸种温度的增加，丙二醛含量呈先降低后增加的趋势，预浸种时间则与之相反，呈现先上升后降低的趋势。结果表明，处理6丙二醛含量最低，处理8丙二醛含量最高；在常温下预浸种30 min，然后在20℃保湿24 h，甜菜种子对逆境条件反应较强，细胞膜质过氧化水平也相对稳定；在常温下预浸种20 min，然后在30℃保湿24 h，甜菜种子对逆境条件反应较弱。

图3 不同引发组合丙二醛处理结果

2.2.2 抗氧化酶 SOD结果（图4）显示，对照与3个不同温度、预浸种时间的组合处理差异均不显著，处理1、6与处理8差异显著(P＜0.05)。处理8相比对照上升了74.17 U/g，而处理1、6则分别下降了66.46、43 U/g，处理1、6、8随着温度的增加呈逐渐上升的趋势，而随着预浸种时间的增加则是呈先上升再下降的趋势。CAT结果（图5）显示，对照与3个不同温度、预浸种时间的组合处理差异均不显著，处理1、8与处理6差异(P＜0.05)显著。处理1、8相比对照分别上升了44.78、24.88 U/(g·min)，而处理6则下降了34.82 U/(g·min)，处理1、6、8随着温度的增加呈现先降低再增加的趋势，而随着预浸种时间的增加则是呈现逐渐下降的趋势。POD结果（图6）显示，对照与处理6差异不显著，但却与处理1、8差异显著(P＜0.05)。处理1和处理8相比对照上升了2.14和3.48倍，虽然处理6与对照差异不显著，但是比对照上升了1.21倍，3个处理随着温度的增加呈现先下降再上升的趋势，但是随着预浸种时间的增加则出现先上升再下降的趋势。结果表明，处理8的SOD、POD活性最强，处理1的CAT活性最强，处理6的CAT、POD活性最弱。总体上，在常温下预浸种20 min，然后在30℃保湿24 h的处理其抗氧化酶活性是最强的，能够有效地消除逆境胁迫所产生的过氧化伤害。

图4 不同引发组合SOD处理结果

图5 不同引发组合CAT处理结果

图6 不同引发组合POD处理结果

3 讨论

种子引发的方法多种多样，但是水引发相较于其他引发方法具有诸多优点，在保证引发效果的同时更易于获取、推广。水引发已应用到多种植物的引发研究，但是对于甜菜种子的研究却鲜有报道，因此对于甜菜种子萌发具有重要意义。如刘慧霞等[16]在水引发对紫花苜蓿种子萌发及其生理活动的影响研究中发现，水引发能够在萌发速率、萌发一致性以及修复生物膜、增强细胞结构稳定性以及抗逆性上具有显著作用。马向丽等[17]通过水引发对不同贮藏年限纳罗克非洲狗尾草种子活力的影响研究发现，经过水引发的种子，可溶性糖、可溶性蛋白含量以及POD、CAT活性均有所上升，SOD活性先降低后升高。

水引发方法具有多种方式，如两段浸种法、预浸种再保湿法、直接浸种法、控制给水法等，也有选择自来水、去离子水等作为引发溶剂的。因此本研究的创新点在于将预浸种再保湿法和温度相结合，筛选出好的组合处理。如黄如葵[18]在对水引发技术对三倍体西瓜种子发芽性能的影响研究中，先浸种2 h，然后在20℃相对湿度100%的环境中分别培养24、48 h，结果表明，种子的贮藏性能以及抗衰老能力得到增强。李振华等[19]研究水引发对烟草活力和萌发特征的影响，采用去离子水直接浸种24 h，结果表明低活力的种子萌发率基本也都达到90%以上。闵丹丹等[20]在紫花苜蓿种子水引发条件的优化研究中，采用了控制给水的方法，发现温度在10℃、引发时间为36 h、引发加水量为种子初始重的90%时种子的活力指数最高，可作为紫花苜蓿种子引发的最适条件。

电导率以及丙二醛反映细胞膜的完整性以及膜脂过氧化的成程度，是膜系统是否受到伤害的重要标志之一[21-22]。抗氧化酶的增强意味着植物膜脂过氧化过程减缓，抗逆性提高[23]。如贺红娟等[24]研究水引发对油松种子及幼苗的生理效应及其作用机制，表明种子的可溶性糖、可溶性蛋白以及幼苗的过氧化氢酶、过氧化物酶均得到了提高。张同祯等[25]研究水引发对‘郑单958’玉米种子萌发及幼苗生理特性的影响，发现12 h的水引发处理能够促进种子萌发，而且可溶性糖、可溶性蛋白增加，抗性酶增强。本研究运用蒸馏水作为引发剂设置不同的预浸种时间和温度组合引发甜菜种子TD802，根据活力指数以及电导率，筛选出不同预浸种时间以及温度效果较好的3组处理进行生理试验，发现处理6的抗氧化酶活性以及丙二醛含量均是最低。处理8的抗氧化酶活性最高，但是丙二醛含量也是最高的。处理1的丙二醛含量不是最高，同时抗氧化酶活性也不是最低，具有一定的稳定性。

本研究不足之处在于甜菜种子预浸种时间较短，时间区间不大；在甜菜保湿阶段未设置时间梯度，只设定为24 h，未做保湿阶段时间上的处理对比。国内现阶段甜菜引发研究还只是处于初级阶段，对甜菜水引发方面更是少之又少，今后可采用自来水、去离子水等引发试剂多做研究，设置不同的温度、时间、浸种方法等，筛选出更多适宜甜菜种子水引发的条件。

4 结论

本研究中不同温度、预浸种时间组合处理的9个处理对甜菜种子的萌发特性各有不同且均高于对照，3个最佳组合的生理特性则各不相同。在9个组合处理中，处理9的发芽率、发芽势最高，处理5的发芽指数以及临界阈值最高，处理6的活力指数最高。甜菜种子活力结合电导率可以做出更加准确的判定。其中处理1为10℃以及预浸种10、20、30 min的最佳组合，处理6为20℃以及预浸种10、20、30 min的最佳组合，处理8为30℃以及预浸种10、20、30 min的最佳组合。随着温度的增加，丙二醛、POD、CAT都呈现先下降在上升的趋势，但是随着预浸种时间的增加，丙二醛、SOD、POD则是先上升再下降的趋势。综合3个酶活力指标来看，处理8的酶活性最强，但是该处理的丙二醛含量也是最高，表明处理8在消除过氧化伤害的同时对逆境条件反应较弱。处理6的酶活性最弱，相对的该处理的丙二醛含量也是最低，表明处理6对逆境条件反应较强，细胞膜质过氧化水平也相对稳定。相较于处理6和处理8，处理1的丙二醛含量不是最高，同时抗氧化酶活性也不是最低，表明处理1细胞膜质过氧化水平稳定的同时能够有效消除逆境胁迫所产生的过氧化伤害。结果表明，水引发处理对甜菜种子具有明显的促进作用，其中处理1引发效果最稳定，能够更好地在增强种子活力的同时提高种子的抗逆性。