NOX介导氧化应激与听力损失的研究进展

何蒙娇，谌 容，汪海燕，桂 飞，宋丹丹，杨 磊

杭州师范大学医学部公共卫生学院，杭州 311121

听力损失是人类最常见的感觉障碍形式，其症状表现为从轻度听觉障碍到完全性耳聋[1]。根据《2019 年全球疾病负担研究报告》显示，2019年有15.7亿人患有听力损失，占全球人口的20.3%，预计到2050年，全球将有24.5亿人患有听力损失[2]。听力损失大致分为两种类型：获得性听力损失和遗传性听力损失。众所周知，获得性听力损失包含年龄相关性听力损失(age related hearing loss or presbycusis，ARHL)、噪声性听力损失(noise-induced hearing loss，NIHL)和药物所致听力损失(drug-induced hearing loss，DIHL)。听力损失是全球第三大致残原因[2]，不仅会降低患者的生活质量，使他们变得孤立、抑郁、认知缺陷，而且会导致沟通困难进而失去就业机会，对社会造成间接损失[3]。目前，有关听力损失的发病机制存在多种学说，如机械学说，血管学说，耳毒性药物学说，氧化应激学说等。近年来，研究者越来越关注氧化应激。氧化应激是活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成和清除失衡，过量的活性氧引起分子、细胞和组织氧化损伤的现象，与多种疾病的发病机制密切相关，通常是指参与ROS产生的酶的功能障碍[4-5]。ROS可由酶产生，包括线粒体电子传递链、一氧化氮合酶、细胞色素P450还原酶和黄嘌呤氧化酶在内的多种酶产生[4]。ROS是作为上述酶的主要催化功能的副产品或酶的功能失调而产生的[6]。然而，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH氧化酶)，又称为NOX，是唯一主要功能为产生ROS的酶。因此，本文综述了NOX介导氧化应激与听力损失病理机制的最新研究进展，旨在为了解听力损失的发病机制提供与NOX相关的信息。

NOX家族及其功能

NOX与年龄相关性听力损失

ARHL是老龄化社会中一种常见的退行性神经感觉障碍，在临床上又称老年性聋，发病从高频听力损失开始，并伴随着言语识别力的下降，其病理学特点包括毛细胞丢失、带状突触减少、血管萎缩、螺旋神经节神经元的丧失以及中枢听觉通路的退化[12-13]。目前，研究表明氧化应激是ARHL的重要机制之一。随着年龄的增长，耳蜗氧化还原环境发生了变化[14-15]。同时，成年人的内耳再生能力减弱，ROS产生增加和抗氧化防御减弱导致氧化还原稳态的破坏，进而引起渐进性的听力损失[16]。在此背景下，一些抗氧化基因，如普通超氧化物歧化酶2，已被证明与ARHL有关[17]。此外，研究发现ARHL动物模型体内NOX亚型表达水平上升，提示ARHL与以NOX介导氧化应激存在一定关系。

在注射D-半乳糖(D-galactose，D-gal)引起的衰老大鼠模型中，Du等[18]观察D-gal处理的大鼠腹侧耳蜗核(ventral cochlear nucleus，VCN)的H2O2、NOX2及其相应亚基p22phox、p47phox的表达均显著高于对照组；VCN中氧化应激的典型生物标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)和线粒体DNA共同缺失(common deletion，CD)也明显增加。此外，D-gal诱导的VCN线粒体超微结构受损，ATP水平下降，线粒体膜电位丧失，细胞色素c转运量增加，caspase-3激活。结果表明NOX2依赖性氧化应激可能会导致线粒体损伤并激活中枢听觉神经系统的caspase-3依赖性凋亡通路，为老年性聋提供新的见解。为探讨ARHL带状突触损伤的早期因素，Du等[13]研究发现与对照组相比，D-gal处理小鼠的带状突触及其神经纤维数量显著减少，而毛细胞、间质细胞和螺旋神经节细胞数量几乎没有变化。尽管D-gal诱导的衰老并未使8、16和32 kHz频段的听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)阈值显著改变，但与对照组相比，D-gal处理组小鼠的ABRⅠ波(反映带状突触功能)的振幅和潜伏期出现异常，证实该模型体现了老年性耳聋的早期损伤。此外，Du等[13]还发现D-gal处理组小鼠耳蜗8-OHdG、H2O2、NOX2和线粒体3860 bp共同缺失的水平显著高于对照组，结果表明耳蜗带状突触是老年性耳聋早期的主要损伤部位，而线粒体氧化损伤和随后的功能障碍可能是造成这种损伤的原因。由于p22phox亚基对NOX亚型(即NOX1-NOX4)的功能至关重要，p22phox缺失小鼠成为研究内耳中NOX功能的经典模型。Rousset等[10]利用上述模型，发现野生型小鼠(Cdh23erl/erl)表现出早期听力损失和耳蜗完整性的丧失，而p22phox缺失小鼠在长达6个月的时间里未表现出听力损伤，经机制研究，发现p22phox缺失小鼠的听神经元中兴奋性通路基因表达下调。结果提示NOX亚型失活可通过下调兴奋性通路基因表达来实现ARHL的保护作用。综上所述，NOX2依赖性氧化应激可能会激活中枢听觉神经系统的caspase-3依赖性凋亡通路，而其余NOX亚型在ARHL的功能作用尚待进一步研究。

NOX与噪声性听力损失

噪声暴露是全球成年人听力损失的最常见病因。噪声创伤会使内耳感觉毛细胞死亡，产生的ROS会对外毛细胞、血管纹和螺旋神经节细胞造成损害，导致听力损失[19-20]。NIHL的特征是ABR检测到的听力阈值升高，纤毛结构破坏和毛细胞丢失[9]。研究表明，过量ROS形成是噪声引起耳蜗毛细胞损害的一个主要原因。当暴露于噪声后，耳蜗中ROS产生先于形态学损伤[21]。Ramkumar等[22]证实噪声触发的耳蜗中ROS产生的一个来源是NOX。然而，由NOX产生的ROS造成NIHL的机制尚不明确。

Vlajkovic等[23]将大鼠持续暴露于8～12 kHz，声压级为100 dB或110 dB的噪声中24 h，发现噪声暴露引起的NOX1和DUOX2表达升高，引起耳蜗损伤，但NOX3表达下降，这可能是因为耳蜗为了降低噪声诱导的氧化应激进而引起的一种内源性保护机制。此外，NOX抑制剂二联苯碘(diphenylene iodonium，DPI)干预可部分保护耳蜗免受噪声引起的听力损失。Bahaloo等[24]将大鼠连续10 d暴露于10 kHz，声压级为100 dB的噪声中24 h，发现噪声暴露会引起NOX3基因表达下调和氧化(或抗氧化)平衡的异常，当添加5 mg/kg的抗氧化剂杨梅素可显著逆转上述变化。结果提示，杨梅素可作为预防NIHL的抗氧化剂候选药物之一。Lavinsky等[25]将NOX3突变体(Nox3het/Nox3het)和杂合子(Nox3het/+)小鼠暴露于108 dB的10 kHz倍频程噪声中2 h，畸变产物耳声发射和听性脑干反应测试发现突变体和杂合子小鼠对NIHL表现出更高的敏感性，尤其是在8 kHz倍频程噪声水平。上述研究均证明，噪声暴露可降低动物模型的NOX3表达水平进而降低氧化应激，保护耳蜗免受噪声引起的听力损失。但是，Dhukhwa等[26]将大鼠暴露于122 dB的16 kHz倍频程噪声1 h，发现噪声暴露会导致大鼠耳蜗中的NOX3、耳蜗损伤的生物标志物——瞬时受体电位香草素通道(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)和炎性介质的早期增加，阻断上述通路的任何一个环节都可预防和治疗NIHL。Morioka等[27]通过建立NOX4转基因的小鼠品系，该小鼠品系是一个由NOX4介导产生过量ROS的动物模型，将转基因小鼠暴露于110 dB的8 kHz倍频程噪声中持续1 h，发现转基因小鼠在噪声暴露后表现为加速高频声音听力损失的发生发展，提示NOX4介导产生ROS可能与NIHL相关。此外，Morioka等[27]研究发现NOX4可以上调热休克蛋白(heat shock protein 47，HSP47)的表达，进而抵抗ROS引起的听力损失。细胞外高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB1)是一种促炎因子，在ROS生成中起着重要作用[28]。Shih等[29]研究发现在白噪声暴露前腹腔注射抗HMGB1，可明显降低ROS形成及NOX4水平，降低毛细胞损失及ABR阈值变化，进而减轻噪声诱导的听力损失。

目前，有关NOX介导氧化应激与听力损失的研究绝大部分集中在细胞水平和动物模型水平。在人群水平研究层面，Zhao等[30]分析了噪声职业中工业人口的噪声峰度，NOX3遗传变异，生活方式因素及其与NIHL的相互作用。rs12195525基因座位于NOX3的编码区，有两个突变，G→A(精氨酸变成终止子)和G→T(精氨酸变成精氨酸)，通过与携带GG基因型的受试者相比，发现携带rs12195525的变异等位基因(TT或GT)的受试者发生NIHL的风险降低，提示NOX遗传变异是NIHL的保护因素，NOX3遗传变异与吸烟、观看视频量等生活方式存在正向交互作用，其功能和分子机制仍需进一步研究。综合现有文献，NOX产生的ROS参与NIHL的发生发展，通过NOX抑制剂(DPI)或者抗氧化剂(杨梅素)可以在一定程度上对抗噪声引起的听力损失，恢复听功能。

NOX与药物所致听力损失

目前，两类化合物的耳毒性研究最多，即氨基糖苷类抗生素和铂类化合物。其中，铂类化合物的耳毒性和NOX3之间的关联实际上已有较好的证明[31]。顺铂是临床常用的抗肿瘤药物，具有肾毒性、神经毒性和耳毒性等严重不良反应。顺铂所致的听力损失是一种永久性的、多发生在双侧的听力损失，对成年人甚至是儿童的学习发展和社会融入都会产生负面影响[32]。研究表明，ROS的过量产生与顺铂的耳毒性相关[33]。目前，包括NOX3在内的NOX家族在ROS产生中的表达和作用以及对顺铂暴露的耳蜗或听觉毛细胞的毒作用机制尚不清楚。

Kim等[33]研究发现顺铂在体外和体内均诱导NOX1和NOX4表达上升，在体外研究中，用NOX抑制剂DPI可以降低顺铂处理的永生听觉毛细胞和科蒂(Corti)器中ROS的产生和随后的细胞凋亡，表明NOX家族通过激活细胞内ROS的产生，参与了顺铂的细胞毒性。Mukherjea等[34]经鼓室注射NOX3 siRNA可以保护大鼠外毛细胞免受损伤，降低毛细胞、螺旋神经节神经元和血管纹中NOX3的表达以及凋亡基因Bax的表达，上调抗凋亡基因Bcl-2表达，减少顺铂诱导的耳蜗细胞凋亡；此外，NOX3 siRNA还可降低耳蜗损伤的生物标志物TRPV1和肾脏损伤分子-1(kidney injury molecule-1，Kim-1)的表达，以上结果提示NOX3调控耳蜗中的应激相关基因(TRPV1和KIM-1)，并启动耳蜗中的细胞凋亡，进而导致耳毒性。Shin等[35]在大鼠模型中经鼓室给药的新型合成化合物3-氨基-3-(4-氟-苯基)-1H-喹啉-2，4-二酮[3-amino-3-(4-fluoro-phenyl)-1H-quinoline-2，4-dione，KR-22332]对顺铂诱导的听力损失具有保护作用。KR-22332可能通过抑制线粒体功能障碍和抑制ROS的产生来预防顺铂所致的耳毒性。数项动物研究和一项临床试验均证明鼓室内给予地塞米松对顺铂引起的听力损失具有保护作用[36]。地塞米松可降低顺铂诱导的氧化应激、NOX3和细胞凋亡水平，保护顺铂诱导的大鼠Corti器的基底部毛细胞免受损伤[36]。银杏内酯B(Ginkgolide B，GB)在体外和体内对顺铂诱导的耳蜗细胞毒性均具有保护作用[37]。GB作为银杏叶提取物的主要成分之一，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化等作用[38-39]。增强核转录因子E2相关因子-血红素加氧酶-1(nuclear factor erythroid 2-related factor 2-heme oxygenase，HO-1，Nrf2-HO-1)信号通路是对抗氧化应激的主要细胞防御机制[40]，Ma等[37]发现GB通过降低NOX2表达并通过激活蛋白激酶B信号，增强Nrf2-HO-1抗氧化途径，减少ROS的产生。此外，Ma等[41]研究发现GB通过上调microRNA 214(miR214)，抑制p53调节的NOX4和p66shc的表达，进而降低p53介导的促氧化作用，减少超氧化物的产生和抑制细胞凋亡，降低顺铂诱导的耳蜗细胞毒性。以上研究均证明，NOX与药物所致听力损失密切相关，并且与炎症、凋亡相关，亟待进一步从氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等方面深入阐明NOX与药物所致听力损失发生发展的相关病理机制及药物作用机制。

小结与展望

以NOX介导氧化应激是大多数衰老性疾病的共同通路，虽然多数研究者已开展较多有关听力损失的研究，但相关发病机制仍不清楚，如何预防、减缓和治疗听力损失有待进一步探索和研究。氧化应激和炎症是听力损失常见的特征，而NOX家族的亚型可能是防治听力损失的潜在靶点，虽然有研究报道NOX1、NOX3和NOX4在不同类型听力损失中表达不同，但目前其对防治听力损失的确切作用尚不清楚。因此，需要更多研究来评估NOX亚型在不同类型听力损失中的潜在作用机制。