粗针穿刺确诊马尔尼菲篮状菌感染性淋巴结炎的临床病理分析

杨金玲，仇以利，王婉玲，朱 焱，蔡雪玉，刘江福，张宏图，陈一峰

福建医科大学附属泉州第一医院 1病理科 2检验科 3病案室 4感染科，福建泉州 362000 5国家癌症中心 国家肿瘤临床医学研究中心 中国医学科学院 北京协和医学院 肿瘤医院病理科，北京 100021

马尔尼菲篮状菌(Talaromycesmarneffei，TM)主要存在于东南亚和我国南方等潮湿多雨地区的土壤、植被和空气中。人类首例感染TM病例早在1959年就已被报道，之后直到1981年国际上才首次报告艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)病例[1]，而随着实验室检测技术的完善和提高，越来越多的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者在东南亚被发现，继发TM机会性感染的病例数也呈相应增长态势。然而TM感染并不局限于AIDS高危人群，恶性肿瘤、慢性消耗性疾病、器官移植、长期使用皮质类固醇激素或免疫抑制药物等的一般人群受累的病例数也在同步增长。单纯TM感染与AIDS非潜伏期的症状相似度较高，特别当患者出现全身淋巴结肿大时，临床上很难区分患者是否继发TM感染，而延误诊疗的TM感染患者的死亡率高达75%[2]。因此，本研究收集近6年福建医科大学附属泉州第一医院诊治的TM感染性淋巴结炎15例，分析其临床病理特点，旨在提高对TM感染性淋巴结炎的认识，尽可能地挽救面临TM感染死亡威胁患者的生命。

资料和方法

资料收集2015年1月1日至2021年10月1日福建医科大附属泉州第一医院通过血液、痰液、肺泡灌洗液或淋巴结抽出液TM培养及鉴定的阳性病例142例，其中15例伴有全身浅表淋巴结肿大，均接受粗针穿刺活检。本研究经福建医科大学附属泉州第一医院伦理委员会批准，伦理审查编号：〔2021〕167号。

方法查阅电子病例系统记录患者临床表现、实验室及影像学检查结果、诊疗及转归情况。超声引导下用18G的活检针穿入肿大的浅表淋巴结，取出3～5条病变组织，经10%中性福尔马林固定，脱水包埋后制成切片，行常规HE染色、抗酸染色及其他特殊染色。淀粉酶消化后过碘酸希夫(diastase periodic acid-Schiff，D-PAS)染色：切片脱蜡，淀粉酶(福州迈新生物技术开发有限公司)溶液处理，高碘酸染色10 min，Schiff液染色20 min，偏重亚硫酸钠1 min(2次)，自来水冲洗10 min，脱水、透明、封固。六胺银染色：切片脱蜡，高碘酸染色5 min，六胺银原液(北京中杉金桥生物技术有限公司)和六胺银缓冲液各1～2滴并混匀，56 ℃孵育1 h，氯化金调色液1滴10 s，水洗、酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。EB病毒编码核糖核酸(Epstein-Barr virus encoded ribonucleic acid，EBER)原位杂交：在BenchMark Ultra全自动免疫组织化学染色仪(美国Ventana公司)上编辑程序，切片脱蜡、放入托槽，经细胞修复、蛋白酶消化、EBER探针杂交染色、复染，流程运行结束后取出切片，洗涤、干燥、封片。

结 果

临床资料15例伴有浅表淋巴结肿大的TM感染患者中，男14例，女1例，年龄26～67岁，平均(49.1±11.87)岁，累及区域包括颈部、锁骨上、腋窝、腹股沟等部位。其中，AIDS患者13例，均经泉州市疾病控制中心蛋白免疫印迹法确诊；2型糖尿病患者2例。多以发热、咳嗽、咳痰等呼吸道症状为主，仅1例以淋巴结肿大为首发临床表现(表1)。全腹平扫及增强CT显示腹腔和/或腹膜后淋巴结肿大6例；胸部平扫CT显示双肺多发斑片状、结节状、条索状高密度影13例，空洞形成2例，磨玻璃密度影2例，肺门和/或纵隔淋巴结肿大10例。

表1 患者的临床资料

真菌培养及其他病原体检测15例患者的送检标本在28 ℃培养时均可见菌落呈霉菌相；35 ℃培养时呈酵母相，并可见有横隔的腊肠样真菌孢子。其中，13例31次血真菌培养TM阳性，3例5次痰真菌培养TM阳性，1例1次肺泡灌洗液真菌培养TM阳性，3例6次淋巴结抽出液真菌培养TM阳性。9例患者存在多重感染：口腔和/或食管念珠菌病3例，巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)视网膜炎2例，肺曲霉菌病1例，血培养沃氏葡萄球菌阳性1例，5例外周血EB病毒DNA拷贝数>1000拷贝/ml，2例EBER原位杂交实验结果阳性(图1)，6例外周血CMV DNA拷贝数>500拷贝/ml。

病理检查15例患者送检样本中，8例显微镜下形态以吞噬病原体的组织细胞弥漫性浸润为主(图2)，淋巴细胞及浆细胞稀少；5例以广泛凝固性坏死为主(图1)伴散在少量病原体及核碎屑；2例糖尿病患者镜下以成纤维细胞小结节状增生改变为主，多核巨细胞少、散在分布，肉芽肿结构形成不良(图3)。病原体大小、形态较一致，直径约3 μm，呈圆形、椭圆形或腊肠状，团聚成簇，如桑葚样。D-PAS(图4)及六胺银(图5)染色可见包含横隔的菌体结构。

图1 EB病毒编码核糖核酸(EBER)原位杂交显示凝固性坏死组织，散在阳性细胞核(黑色)

图2 HE染色显示淋巴组织结构受破坏，吞噬细胞弥漫性浸润

图3 HE染色显示类上皮样细胞聚集呈肉芽肿结构

图4 淀粉酶消化后过碘酸希夫染色显示桑葚样排列的TM，可见腊肠样结构及横隔(箭头)

图5 六胺银染色显示吞噬细胞胞质内的TM

讨 论

1956年TM首次从越南的竹鼠中分离出来，1959年的一次实验室意外针刺事故，在手指刺伤部位出现小结节及同侧腋窝淋巴结肿大，由此证实了TM对人类的致病性[1]，并拉开了人类感染TM报道的序幕。每年全球约150万人死于双相型真菌感染，TM是为数不多的双相型真菌，自然环境中的菌丝相进入人体后，在温度及多种复杂机制的作用下转换为致病性的酵母相[3]，TM适于生存在湿润温暖的土壤，东南亚及我国南方诸省成为TM感染性疾病的流行地区，雨后田间耕作等类似的户外活动会增加受感染的机会，因此了解个人活动及其相关的旅居史有助于避免漏诊TM感染性疾病。竹鼠及其粪便污染的泥土是TM传播的媒介，TM可经粪口、吸入气溶胶孢子、胎盘传播[4]，威胁着AIDS和免疫功能低下患者的身体健康甚至生命安全。

本组13例AIDS、2例非AIDS的糖尿病患者，多以发热及咳嗽、咳痰等呼吸道症状为主诉入院，仅1例以淋巴结肿大为主诉入院，说明淋巴结感染往往是患者全身侵袭性病变晚期阶段的突出表现之一，加上AIDS或糖尿病等基础性疾病造成患者全身衰竭的征象，越容易引发临床怀疑淋巴瘤或结核等。15例均有颈部、腋窝、腹股沟等多发性浅表淋巴结肿大，便于粗针穿刺活检协助明确诊断。吞噬细胞弥漫性浸润、坏死、肉芽肿性炎症是TM的主要病理变化，在本组15例患者的组织样本中所占比重不一，最特征性改变是病变组织的细胞内外可见椭圆形、腊肠样真菌酵母体，桑葚状聚集，D-PAS及六胺银染色显示包含横隔的菌体结构。正常人体的巨噬细胞被T淋巴细胞产生的细胞因子激活，通过L-精氨酸依赖性一氧化氮等途径抗击病原体。MP1基因编码的蛋白Mp1p不仅是TM的关键毒力因子，而且能协助TM逃避巨噬细胞的免疫杀伤，持续在巨噬细胞胞质内存活而发挥毒性作用[5]。本组8例TM感染合并AIDS患者，均以含菌体的吞噬细胞弥漫性浸润受破坏的淋巴组织为主要病变，说明吞噬细胞未能及时清除TM；另5例TM感染合并AIDS患者，以凝固性坏死为主要改变，周围残留少量吞噬细胞，TM数量少，易被忽视。本组2例TM感染合并糖尿病患者，以肥胖的成纤维细胞小结节状增生形成肉芽肿结构为主，其间多核巨细胞少、散在分布，这些改变明显与AIDS患者TM感染性淋巴结炎的病理变化不同，可能与信号转导与转录激活因子1磷酸化受抑制和γ干扰素自身抗体的作用导致辅助T淋巴细胞1亚群的功能缺陷有关[1]。

近些年非AIDS感染TM的病例逐渐增加[6]，本研究报道2例糖尿病患者，还可见于肾移植[7]、肺癌[8-9]、急性髓系白血病[10]等患者。随着基因靶向和免疫抑制抗肿瘤药物的推广使用，非AIDS的TM感染率也在增加，研究发现，这部分患者年龄明显偏大，血白细胞、CD4阳性淋巴细胞和血小板计数较高，但丙氨酸转氨酶水平较低，更容易出现Sweet综合征和骨关节病变，发热、脾肿大和脐周皮肤病变发生的可能性较小[1]。Chen等[2]研究认为低电解质水平、低血红蛋白血症和中性粒细胞减少有助于非AIDS的TM感染的早期诊断。为了明确病原体，有必要进行微生物学检查。本组15例患者血液、肺泡灌洗液、痰液或者淋巴结抽出液真菌培养均查见TM生长，同时需警惕存在多重感染的可能，本组9例合并CMV、EB病毒、念珠菌、曲霉菌、沃氏葡萄球菌感染。TM感染有时与肿瘤的影像表现相似[11]，特别是本组具有磨玻璃密度影、结节状高密度影和/或空洞形成的病例值得警惕。也有研究报道TM感染影像表现类似间质性肺炎，对诊断提出了挑战[12]，所以结合粗针活检病理检查、肺泡灌洗液真菌培养等结果进行综合判断显得尤为重要。

组织胞浆菌是具有传染性的双相真菌，呈窄颈单芽孢繁殖，有荚膜无横隔。杜利什曼原虫胞质淡染，可见动基体及鞭毛，胞质内容物D-PAS染色明显着色，细胞膜呈细颗粒不连续或不着色。而TM细胞壁着色、胞质内容物不着色。分子检测有利于甄别TM与其他病原体，菌体PCR扩增产物经测序分析，上传至美国国立生物技术信息中心网站(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对，明确具体菌种[13]。2016年的一项关于中国2442例HIV血清阳性住院患者的调查研究中发现TM血液感染率达18.8%[14]。Hee等[15]报道AIDS患者TM感染的死亡率为13.5%(7/52)，而非AIDS患者TM感染的死亡率高达60%(6/10)。有的患者因早期误诊为结核采取抗结核治疗的疗效不佳而辗转多家医院，延误了最佳治疗时机[16]。因此，对于无法解释的多系统损害且有东南亚及我国南方流行区旅居史的患者，应高度怀疑TM感染[17]。目前专家共识推荐对所有TM感染患者进行二级预防，流行区HIV感染者在CD4阳性T细胞计数小于100/μl时应进行一级预防[18]。

综上，本研究结果表明，TM易侵犯存在AIDS、糖尿病等基础性疾病的免疫力低下的患病人群，容易被忽视而延误诊疗，且常合并EBV、CMV、细菌等多重微生物感染而导致病情复杂、恶化，诸多因素造成TM感染者的高死亡率。依据流行病学调查了解患者的暴露史、借助淋巴结粗针穿刺活检等检查技术，尽早确诊TM感染，以免延误治疗危及患者生命。