基于抗炎生物效价的甘草传统感官评价科学性研究△

王钧楠，周永峰，崔园园，巩颖，柏兆方，朱广伟，华国栋，张萍*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.解放军总医院 第五医学中心，北京 100039；3.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；4.北京中医药大学 东方医院，北京 100078；5.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；6.北京中医药大学 东直门医院，北京 100700

甘草来源于豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根及根茎[1]，是中药大品种之一，在中药应用中具有十分重要的地位，被誉为中药中的“国老”。甘草质量是其临床疗效的保证。感官评价是甘草质量评价的一种重要方法，主要是根据药材的形、色、气味、断面等性状信息来判断质量的优劣，这种质量评价方法来源于古代临床应用的总结，具有直观简便等优势[2]。但是由于这种传统的评价方法存在主观性较强等问题，其是否还适用于现代的甘草质量评价、能否准确反映其临床活性的差异性有待进一步探讨。

甘草调和诸药，在临床上应用广泛，具有抗炎、保肝、调节免疫等多种药理活性[3]。现代研究表明，多种疾病的发生和发展都伴随着炎症的产生[3-6]，抑制炎症反应是甘草发挥多种药效作用的共性特征。因此，抗炎可能是甘草质量评价的一个重要指标。炎症小体是炎症反应的重要组成部分，与众多炎症性疾病及免疫性疾病密切相关，包括黑素瘤缺乏因子2（AIM2）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、NLR 家族CARD 结构域包含蛋白4（NLRC4）等[7]。NLRP3 炎症小体是其中最具有特点的一种，能够被多种刺激剂（如尼日利亚菌素、三磷酸腺苷等）激活，也因此成为目前国内外研究最广泛、最深入的一类炎症小体。激活后的炎症小体可通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）对白细胞介素-1β（IL-1β）及IL-18 前体物质进行水解，最终产生并释放活性IL-1β、IL-18 炎症因子，介导炎症反应的发生[8]。

本研究借助现代测量工具及分析仪器，将甘草的性状特征定量化，与根据抗炎生物效价分级后的甘草样品进行整合分析，考察各性状特征与抗炎活性的关联度，旨在考察甘草传统感官评价能否准确地反映其抗炎活性，以期为甘草感官评价的实际应用提供参考，并为其科学性提供数据支持。

1 材料

1.1 仪器

CM-5型色彩色差仪（日本柯尼卡美能达公司）；FOX 3000 型电子鼻系统（法国Alpha MOS 公司）；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）系统、TC10 型自动细胞计数仪均购自美国Bio-Rad公司；JJT1300型洁净工作台（北京冠鹏净化设备有限公司）；TGL-16M 型台式高速离心机、HERAcell vios 160i 型恒温二氧化碳培养箱均购自美国Thermo公司；HW·SY11-K 型电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；OV200 型台式真空冷冻离心浓缩仪（北京吉艾姆科技有限公司）；SN510C 型立式压力蒸汽灭菌器（重庆雅马拓科技有限公司）；OZ17581、OZ13247、OZ05171 型微量移液器（德国Eppendorf 公司）；Promega GloMax 20/20型发光检测仪（美国Promega公司）。

1.2 实验动物

无特定病原体（SPF）级C57BL/6 雌性小鼠2 只（9～11 周龄），购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，本研究经中国人民解放军总医院第五医学中心审查，实验动物伦理审查编号为IACUC-2020-0037。

1.3 试药

DMEM 培养基（批号：K0111200）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号：K0911200）、乙二胺四乙酸（EDTA，0.5 mol·L-1，批号：K1905010）、胰蛋白酶（Trypsin）-EDTA消化液（0.25%，批号：K1207050）均购自美国Macgene公司；opti-MEM培养基（批号：31985070，美国Gibco 公司）；巨噬细胞集落刺激因子（M-csf，批号：#87394）、MCC950（纯度≥98%）均购于美国MedChemExpresss 公司；胎牛血清（FBS，批号：2037144，以色列Biolnd 公司）；尼日利亚菌素（Nigericin，批号：HY-100381）、脂多糖（LPS）均购自美国Invivogen 公司；二甲基亚砜（DMSO，批号：1121E0327，德国Sigma-Aldrich 公司）；IL-1βELISA检测试剂盒（批号：2018-3，北京达科为生物技术有限公司）；CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay（批号：0000418489）、Caspase-Glo®1 Inflammasome Assay（批号：0000443211）均购自美国Promega 公司；NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）及Caspase-1 抗体均购自美国Adipogen公司；IL-1β抗体购自美国R&D 公司；辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG 抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体购自美国Santa Cruz公司。

10 个批次甘草样品编号S1～S10，批号分别为J180228001、H190077001-3、20032604、H190080001-3、H190074001-3、H190078001-3、C200015001、J170042001、H190075001-3、CA180140001，经解放军总医院第五医学中心肝病研究所肖小河研究员鉴定均为乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensisFisch。

2 方法

2.1 供试品的制备

按照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版方法[1]制备甘草提取液，抽滤，精密吸取续滤液10 mL 分装于专用离心管中，于台式真空冷冻离心浓缩仪中挥干溶剂至恒重，-20 ℃保存，备用。给药时现配现用，在离心管中加入opti-MEM 培养基1 mL 复溶，超声30 min（250 W，40 kHz）使其溶解至无明显固体颗粒，0.22 μm 微孔滤膜滤过后即得。

2.2 甘草抗炎生物效价的测定

2.2.1 细胞的获取及培养 75%乙醇消毒后，取C57BL/6雌性小鼠后腿骨，将5 mL DMEM培养基用注射器注入骨髓，在装有20 mL DMEM 培养基的离心管中反复吹打3 次，吹打过程中保持后腿骨在培养基液面以下，加入M-csf 5 μL，吹匀，将含有细胞的培养基转移至细胞培养皿中，20 ℃恒温二氧化碳培养箱内培养。3 d 后，补充适量的DMEM 培养基和M-csf，继续培养2 d。然后，将贴壁的小鼠原代骨髓巨噬细胞（BMDM）用消化液[Trypsin-EDTA∶EDTA（2∶1）]消化1～2 min后，更换DMEM培养基，并制成细胞密度为1×106个/mL的培养基溶液，吸取含细胞的培养基500 μL于24孔细胞培养板孔内，于20 ℃恒温二氧化碳培养箱内培养至细胞贴壁。

对于建筑工程，采用以上介绍的装配建筑方案无疑是一个非常好的选择。根据该工程的特点，站内全部取消了建筑物，站内的35 kV、10 kV配电装置均采用E-HOUSE集装箱布置，二次设备采用预制式舱，均由厂家成套供应。土建施工单位仅需进行基础施工即可。

2.2.2 NLRP3炎症小体细胞模型的构建 首先，弃去24孔细胞培养板孔内的DMEM培养基，加入含有LPS（50 ng·mL-1）的opti-MEM 培养基，20 ℃恒温二氧化碳培养箱内静置4 h；然后，设置空白组、模型组及给药组，弃去孔板内的opti-MEM 培养基，给药组分别加入生药质量浓度为0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL-1的甘草提取液，空白组及模型组加入等量opti-MEM 培养基，20 ℃恒温二氧化碳培养箱内与细胞共培养1 h；最后，模型组及给药组内加入Nigericin（50 μg·mL-1，DMSO）溶液，空白组加入含有等质量浓度DMSO 的opti-MEM 培养基，20 ℃下共培养30 min，收集细胞上清液及裂解液。

2.2.3 关键指标的检测 通过蛋白质印迹（Western blot）法对细胞上清液中的IL-1β、caspase-1蛋白及裂解液NLRP3、pro-IL-1β、pro-caspase-1、ASC 等蛋白的表达进行检测，并应用Image J 1.8.0软件对目标蛋白条带进行灰度值分析。取BMDM 上清液及裂解液前处理后，电泳，再经转膜将蛋白条带转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，经过孵育相应的一抗及二抗，显影，在X光片上显示蛋白条带。

通过Caspase-Glo®1 Inflammasome Assay 检测试剂盒对细胞上清液中caspase-1 的表达量进行检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。

通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）对细胞上清液中IL-1β的表达量进行检测，具体操作按照IL-1βELISA检测试剂盒说明书进行。

2.2.4 细胞存活率的检测

通过CellTiter-Glo（CTG）发光法检测细胞存活率。取培养至对数生长期的小鼠BMDM，分别设置空白孔、对照孔及梯度浓度给药孔（生药质量浓度分别为0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL-1），孵育6 h后，吸取细胞上清液50 μL转移至96孔白板中，每孔加入CTG 溶液50 μL，振荡1 min，测定各孔发光强度，并通过公式（1）计算细胞存活率。

2.2.5 生物效价的标化 IL-1β炎症因子是NLRP3炎症小体介导表达的下游关键蛋白，且实验结果相对稳定，故采用ELISA 测定法检测IL-1β的表达量，来表征甘草的生物效价。

以MCC950 为阳性对照化合物，依据《中国药典》2020 年版（四部）[9]【生物检定统计法】项下的“量反应平行线法”对甘草醇提物抑制小鼠BMDM 分泌IL-1β活性的效价值进行标化。定义MCC950的生物效价为1000 U·mg-1，将抑制率和相应给药浓度输入效价计算软件BioCalculate V2.0 得到各个批次甘草抑制小鼠BMDM分泌IL-1β的效价。

2.3 感官参数的数据采集

2.3.1 甘草断面直径（2R）的测量 10 个批次甘草样品均为类圆形片，若为类椭圆形片，则以其短直径作为断面直径测量结果。为了减小实验误差，每批次样品随机取3组，每组100个饮片作为测量对象[10]，记录2R。

2.3.2 甘草色度的测定 色度常用的评价系统是CIE 1976L*a*b*标准色度系统，其中L*表示明度，a*和b*表示不同的色调方向。L*值越大明度越大，感觉越白；反之越暗。a*表示红绿方向，+a*表示红方向，-a*表示绿方向。b*表示黄蓝方向，+b*表示黄方向，-b*表示蓝方向[11]。

采用色彩色差仪对甘草粉末进行色度测量。取适量甘草粉末加入专用容器中，在容器底部平铺成3～5 mm 厚度，校准仪器后，将其放置于测定凹槽内进行色度测量，记录甘草样品的L*、a*和b*值。每批次样品重复测定3次，取其色度指标的平均值。

2.3.3 甘草气味的测定 为了使样品在利用电子鼻检测时响应值达到最佳状态，参考文献[12-13]方法对样品进样量、顶空温度及顶空时间进行单因素考察。精密称取甘草粉末0.2 g，置于10 mL 顶空瓶中，在顶空温度40 ℃、顶空时间120 s 条件下，分别考察进样量为500、1000、2000、2500 μL 时样品的响应值；精密称取甘草粉末0.2 g，置于10 mL 顶空瓶中，在顶空时间120 s，进样量2500 μL条件下，分别考察顶空温度为40、45、50、55 ℃时样品的响应值；精密称取甘草粉末0.2 g，置于10 mL 顶空瓶中，在顶空温度55 ℃、进样量2500 μL 条件下，分别考察顶空时间为120、240、360 s 时样品的响应值。

经过单因素考察，确定电子鼻的检测条件为进样量2500 μL、顶空温度55 ℃及顶空时间240 s，并采用自动顶空进样方式，对甘草样品进行气味检测。取同一批次甘草样品（S7）重复测定5 次，计算12个传感器的RSD 以考察电子鼻仪器精密度。12 个传感 器LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTI、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2 的RSD 分 别 为1.449%、2.933%、2.211%、0.435%、3.278%、1.356%、1.756%、1.133%、1.343%、0.935%、1.641%、1.536%，RSD均小于4%，说明仪器精密度良好。以采集时间为横坐标（X），各传感器响应值为纵坐标（Y）绘制传感器响应曲线，见图1。

图1 电子鼻系统12根传感器对甘草气味的响应强度曲线

按单因素考察后实验条件采集多批次样品的气味数据，按公式（2）计算雷达图面积（S），用于表征甘草的气味信息，并以各传感器最大值绘制雷达图，见图2。

图2 12根传感器对甘草气味的雷达图

式中a、b为两传感器响应值的点与雷达图圆点连线围成的三角形的两边长，c为两边的夹角，均为30°。

2.4 数据分析

将采集的甘草样品感官数据及等级划分数据导入Simca 14.1软件中，进行主成分分析（PCA），并基于PCA 进行正交偏最小二乘法-判别分析（OPLSDA），以增大组间差异，更好地挖掘与甘草抗炎活性相关的关键感官参数。根据PCA 及OPLS-DA 的得分图，判断两等级甘草样品的差异。根据OPLSDA 的loading 图及变量重要性投影（VIP）确定两者间的差异成分，并通过独立t检验分析两者差异成分，验证OPLS-DA结果。

3 结果

3.1 甘草提取物对LPS 联合Nigericin 诱导的小鼠原代骨髓巨噬细胞NLRP3炎症小体的影响

经过Western blot 法检测空白组、模型组及给药组BMDM 上清液及裂解液中各关键蛋白的表达（图3A），再通过灰度值分析对关键蛋白IL-1β，caspase-1及其前体蛋白pro-IL-1β、pro-caspase-1 的条带进行量化（图3B～E），以判断甘草提取物是否产生抑制作用。Lamin B 为细胞裂解液的上样量对照，考马斯蓝（coomassie）染色为上清液的上样量对照。实验结果显示，与模型组相比，给药组细胞上清液中目的蛋白IL-1β、caspase-1 的灰度值明显降低，即其表达量显著减少，并且随着给药浓度的增大，2 种蛋白的表达量呈现逐渐减少的趋势，而在裂解液中两蛋白的前体蛋白pro-IL-1β及pro-caspase-1 的表达则恰恰相反，说明甘草提取物能够抑制pro-IL-1β及pro-caspase-1 的剪切，从而抑制LPS 联合Nigericin诱导的小鼠BMDM 细胞上清液中IL-1β、caspase-1蛋白的表达。甘草提取物对细胞裂解液中NLRP3、ASC蛋白表达无明显影响。通过试剂盒进一步检测IL-1β的表达及caspase-1的活性，结果见图4A、B，发现甘草提取物对IL-1β的表达有抑制作用，并能够抑制caspase-1的活性，且在质量浓度0.312 5～2.500 0 mg·mL-1呈一定的剂量依赖性；对甘草提取物的细胞毒性进行了检测，结果见图4 C，甘草提取物在质量浓度2.500 0 mg·mL-1时对BMDM 无毒性作用，故选取质量浓度0.312 5～2.500 0 mg·mL-1进行药效检测。

图3 甘草提取物对LPS联合Nigericin诱导的小鼠BMDM的NLRP3炎症小体激活的抑制作用（n=2）

图4 甘草提取物的细胞毒性及对LPS联合Nigericin诱导的小鼠BMDM的NLRP3炎症小体通路关键蛋白caspase-1及IL-1β表达的影响（, n=3）

3.2 甘草样品生物效价的标化及分级

根据2.2.4 项下方法进行生物效价的标化，结果见表1。根据生物效价，将10 个批次甘草样品分成2个等级，结果见表2。

表1 S1甘草提取物与MCC950的剂量及对应的IL-1β表达抑制率

表2 10个批次甘草样品的抗炎生物效价及分级结果

3.3 甘草样品的感官参数测定结果

根据2.2 项下各感官参数的测定方法对相应参数数据进行采集，结果见表3。

表3 10批次甘草样品的断面直径、色度值及雷达图面积

3.4 PCA及OPLS-DA结果及验证

PCA 结果见图5，将不同等级的甘草样品分为两类，说明两等级甘草样品在性状特征方面存在一定的差异。进一步应用OPLS-DA 挖掘两组甘草样品的内在差异（图6），R2X和R2Y分别表示所建模型对X 和Y 矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，理论上R2和Q2越接近1 说明模型的拟合准确性越好。该模型R2X=0.534，R2Y=0.863，Q2=0.75，说明模型的拟合能力较好，预测能力较强；loading 图（图7）和VIP 分析，loading 图上距离原点越远，VIP 值＞1的参数对模型的贡献度较大，即成为差异性因素的可能性较大，因而b*和2R可能是导致两组样品差异的关键参数。

图5 甘草样品PCA得分

图6 甘草样品OPLS-DA得分

图7 甘草样品OPLS-DA的loading图

将两组甘草样品的b*和2R实测值进行比较，结果见图8，两者b*的差异有统计学意义（P＜0.01），而2R的差异无统计学意义。

图8 两等级甘草样品的b*及2R的实测值比较

4 讨论

近年来，已经有研究报道了甘草中的活性成分对NLRP3 炎症小体的影响，并对其作用机制进行了深入研究。Li 等[14]研究发现，异甘草素通过抑制磷酸化核转录因子-ĸB（p-NF-ĸB）、NLRP3 的蛋白质的分泌，促进caspase-1、IL-1β和消皮素蛋白N 端（GSDMD-N）的裂解，上调微小核苷酸（miRNA）-27a mRNA 表达，并降低脾酪氨酸激酶（SYK）的mRNA 和蛋白质水平等方式抑制NLRP3 介导的焦亡。付书彬等[15]报道，甘草查耳酮A 可通过抑制caspase-1 前体的剪切，阻断caspase-1 p20 介导的pro-IL-1β的成熟，抑制NLRP3 炎症小体介导的免疫炎症反应。Xu 等[16]也发现了甘草中的活性成分对NLRP3炎症小体的抑制作用。目前，甘草提取物对炎症小体的作用尚无人进行验证，本研究在前人研究[14-16]的基础上构建了炎症小体细胞模型，确定了在体外甘草提取物对LPS 联合Nigericin 诱导的小鼠BMDM的NLRP3炎症小体激活的抑制作用，并通过检测其下游关键蛋白IL-1β的表达量建立了不同批次甘草样品的生物效价，为甘草质量评价提供新的方法。

自古以来，颜色就在甘草质量评价中占据了重要地位。《本草经集注》记载：“赤皮断理，……最佳……”[17]，《新编中药志》记载：“甘草以皮细紧、色红棕、断面黄白色……为佳”[18]。可见，在古代，甘草以外皮色赤、色红棕、断面色黄白者为佳。随着科技的进步，研究者们利用现代仪器对甘草的颜色进行了更深入的研究。曹光昭等[19]将甘草的止咳药效与其色度值进行相关性分析，初步确定了b*与其止咳药效的相关性。本研究通过现代机器视觉客观量化了甘草的性状参数，弥补了性状评价方法过于依赖经验的不足之处，大大提高了其客观性，降低了因评价人员不同而导致的质量评价差异，并且经过进一步与其抗炎活性进行整合分析，确定了甘草的b*与甘草抗炎活性的相关性较强。但由于市场上多为乌拉尔甘草，本研究未收集到胀果甘草和光果甘草样品，并且应用样品量较小，可加大样品量及其他基原甘草样品进行进一步验证。