金定鸭全基因组选择信号检测

李家权，陈吉敏，杨 悦，杨银华，赵芳露，周 劢，肖天放，林瑞意

（福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福州 350002）

我国拥有丰富的鸭遗传资源，在自然选择和人工选择协同作用下，地方鸭表型具有多样性，品种数目多达35个。我国地方鸭约在2 500年前被驯化[1]，为人类提供各种产品（如肉类、蛋类和羽毛等），在生产生活中发挥重要作用。金定鸭原产于福建省漳州市龙海区紫泥镇金定村，属于蛋用型地方麻鸭品种，于2000年列入《国家级畜禽品种资源保护名录》，具有抗病力强、产蛋量多、蛋型大等特点，表现出较强生产性能[2-3]。

在地方品种驯化过程中，以生产为导向的人工选育影响鸭基因组水平变异，特定选择条件造成新的有利突变在群体中迅速固定和扩大，突变周围与之连锁的染色体区域因搭车效应而表现多态性下降[4]。这种选择会在物种基因组上留下特殊痕迹，即选择信号（Selection signature）[5]。在不同群体之间，识别相关选择信号的方法是进行遗传分化系数（Fst）和核苷酸多样性比值（π ratio）分析，Fst 分析可根据遗传信息计算群体间分化程度，π ratio分析则可计算某个位点在两个亚群间多样性差异倍数[6]。结合两种分析方法筛选受选择区域，可更准确分析多群体之间遗传分化距离，对于揭示目标群体进化方向具有重要意义。

选择信号检测广泛应用于人类医学领域，然而对于家畜选择信号研究仍处于起步阶段。李秀领等借助Fst分析对商用大白猪与地方品种通城猪进行全基因组选择信号检测，发现其SNP 位点涉及79 个候选基因，其中NCOA6、ERBB4、RUNX2和APOB等基因与生长繁殖及免疫应答有关[7]。Arora 等对猪进行全基因组测序与选择性清扫分析发现与调节肌肉途径相关候选基因（UGT8、ZGRF1、NDUFA10、EBF3、ELN、UBE2L6、NCALD、MELK、SERP2、GDPD5 和FHL2）[8]。陈建兴等利用Fst 和π ratio 检测山东小毛驴与其他驴群体间选择信号，共找到39 个受选择基因，主要在免疫、生殖、细胞作用等通路中发挥作用[9]。李国辉等发现与边鸡抗寒、耐缺氧、繁殖力、神经系统发育和抗逆性等性状相关基因（HIF1A、HP1BP3、PTGS2、HSD17B4、PLA2G4A、TNFAIP8）受到选择[10]。冯佩诗在绍兴鸭、山麻鸭和樱桃谷鸭种群上获得17 个共同驯化基因，其与心血管发育、平滑肌增殖、胰岛素功能调控等生理活动密切相关[11]。张泽宾对2个野鸭群体和7个家鸭群体78只鸭进行全基因组测序发现，MITF基因影响白羽性状突变位点；检测到GRIK2、GRIN3A、PDC、PIK3C3、PNPLA8、PRKAR2B等292 个与驯化相关基因，大部分参与神经发育、脂肪和能量代谢[1]。

本研究基于全基因组酶切位点的简化基因组测序（RAD-seq）技术对4个不同家鸭品种进行选择信号检测。采用Fst 和π ratio 值联合计算确定受选择区域，分别比较金定鸭与连城白鸭、莆田黑鸭、山麻鸭遗传分化程度和群体间基因组选择信号，确定受选择基因，初步探求金定鸭进化方向，为其遗传资源保护与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品

选择金定鸭（JD）、连城白鸭（LC）、莆田黑鸭（PT）和山麻鸭（SM）为研究对象，每个品种各30只，共120只，由国家水禽品种资源基因库（福建）提供。采集4~6 mL 鸭翅下静脉血液，置于装有柠檬酸钠抗凝管中，-20 ℃冰箱中短暂保存。TIANGEN 血液基因组DNA 提取试剂盒（DP318-03）提取样品DNA，超微量微孔板分光光度计EPOCH2（BioTek Instruments）和紫外凝胶成像仪（Tanon-2500）检测DNA质量和完整性。

1.2 方法

利用PstⅠ酶酶切基因组DNA，加上P1 接头，将DNA 随机打断成300~700 bp序列，再加上P2接头，通过PCR 扩增富集RAD tags，在Illumina HiSeqTM2500 测序仪上进行简化基因组测序，平均测序深度为10×。测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成。

1.3 数据处理与分析

将下机后原始数据运用FASTP软件[12]进行质量控制，应用BWA 软件[13]将质控后高质量数据比对至参考基因组上（GCF_003850225.1），运用GATK软件[14]检测SNP，使用SnpEff 软件[15]注释SNP 信息（VCF文件）。

1.4 选择性清除分析

选择性清除分析可寻找群体受选择区域，进一步确定受选择基因，在分子水平解释群体进化、驯化背后的适应机制。为提高分析准确性，按位点缺失情况过滤原始SNP，得到对应SNP及位置信息，缺失率（Missing rate）超过50%标记位点被过滤，过滤后标记用于定位受选择区域。基于过滤后SNP，使用PopGenome 软件[16-17]，按物理长度进行滑窗，以100 kb 为窗口，10 kb 为步长，将染色体拆分成若干个窗口，分析群体间多样性。固定指数（Fixation index），也称遗传分化指数，即Fst，可根据遗传信息计算群体间分化程度，其计算公式为：Fst=（MSP-MSG）/[MSP+（n-1）MSG]，其中MSP 和MSG 分别为群体间均方差和群体内均方差，n为校正后群体间平均样本大小。Fst 理论值应在0~1 区间内，当Fst=0 时，表示两个群体之间不存在遗传分化，Fst=1，则两个群体间分化达到最大。π ratio分析主要关注某个位点（或区间）在两个亚群间多样性差异倍数，相比Fst关注基因型分化，π ratio关注多样性值高低。受选择群体驯化区段相较于对照群体对应区段，π值更低，两者比值也越高，π ratio中，分母群体为选择群体，分子群体为对照群体。

1.5 受选择区域筛选及基因富集分析

受选择区域筛选可发现不同家鸭群体基因正向选择痕迹，从而定位受选择基因。受选择区域一般是群体内遗传多样性低的染色体区域，同时也是群体间高遗传分化率区域。通过各窗口内SNP位点Fst 和π ratio 值评估该染色体区域是否受选择。根据Fst、π ratio 结果，各自按top 5%筛选两个品种间基因组区域，然后将两个基因组区域交集定义为选择信号，并将重叠窗口合并为一段基因组区域。对筛选出的选择信号进行基因注释，识别选择信号内基因，定义为候选基因或受选择基因。

结合Fst、π ratio 值获得受选择区域候选基因后，对其进行GO 和KEGG 富集分析，了解基因功能，为进一步筛选验证提供线索。

2 结果与分析

2.1 SNP检测结果

从4个家鸭品种中平均检测到140万个SNPs位点，其中金定鸭1 366 205 个，连城白鸭1 297 124个，莆田黑鸭1 655 626 个，山麻鸭1 661 924 个，根据SNPs 位置信息利用R 包VennDiagram 绘制韦恩图（见图1）。由结果可知，金定鸭与连城白鸭群体之间，共享848 976 个SNPs 位点，金定鸭特有517 229 个；与莆田黑鸭相比，共享1 042 950 个SNPs位点，特有323 255个，与山麻鸭相比，共享1 017 557个SNPs位点，特有348 648个。

图1 两两群体间用于分析的SNP数目Fig.1 Number of SNP used for analysis between pairs of populations

2.2 群体间受选择区域筛选

基于过滤后SNP，按滑动窗口方法，分别计算金定鸭、连城白鸭、莆田黑鸭和山麻鸭各窗口内Fst 和π ratio，根据top 5%确定Fst、π ratio 的阈值（见表1）以筛选受选择区域。在金定鸭和连城白鸭两个品种间，将Fst值大于0.44且π ratio值大于2.37基因组区域交集为两个鸭群体间选择信号（见图2A），这些选择信号位于染色体1-15、18、20、21、24、25、28和Z上，并在其中找到349个候选基因。根据表1中阈值，以相同方法，确定金定鸭与莆田黑鸭选择信号（见图2B），受选择染色体为1-14、16、18、19、21、22、28、29和Z，注释到185个候选基因；金定鸭与山麻鸭选择信号（见图2C），受选择染色体为1-14、16、18、19、21、22、24、29 和Z，注释到316 个候选基因。进一步筛选全部候选基因，发现有17个候选基因同时出现在3个比较组中（见图3），分别是ADAMTSL1、AFAP1L2、CCDC186、Cntln、DEPDC1B、DIMT1、ELOVL7、IPO11、KIF2A、LRRC70、PDE4D、RAB3C、SH3GL2、STARD4、Tdrd1、VWA2、ZNF462。

图2 群体间选择信号示意图Fig.2 Schematic of selection signatures between poputions

图3 受选择基因韦恩图Fig.3 Venn diagram of selected genes

表1 选择清除各指标阈值Table 1 Thresholds of indicators for selective sweep

2.3 受选择基因GO和KEGG分析

对候选基因进行GO功能富集分析，富集条目及基因数见图4。在金定鸭和连城白鸭组349个候选基因中，有140 个基因显著富集于324 个GO 条目（P＜0.05），其中包括10 条细胞组分类，29 条分子功能类和285条生物过程类，主要集中在受体结合、运输、对刺激反应调节、细胞过程负调控、生物质量调节等过程。金定鸭与莆田黑鸭组（见图4B）185 个候选基因中，有96 个基因显著富集于199个GO条目，其中包括10条细胞组分类，23条分子功能类和166条生物过程类，主要集中在微管细胞骨架、蛋白质二聚活动、细胞代谢过程等。金定鸭与山麻鸭组（见图4C）316个候选基因中，有158 个基因显著富集于167 个GO 条目，其中包括13 条细胞组分类，38 条分子功能类和116 条生物过程类，主要富集在细胞器、转移酶活性、分子功能调节、氮化合物代谢过程等。

图4 GO富集分析聚类图Fig.4 Gene ontology(GO)enrichment analysis of candidate genes

对候选基因进行KEGG通路富集分析，结果显示，金定鸭比对连城白鸭、莆田黑鸭、山麻鸭受选择基因参与主要生化代谢途径和信号转导途径分别有223条、129条和251条。其中，金定鸭与连城白鸭比较组中显著富集通路有20条（P＜0.05），涉及81个候选基因，从中找到14个可能与金定鸭重要经济性状相关功能基因，主要参与核黄素新陈代谢、PI3K-Akt信号通路、糖鞘脂生物合成等，包括AGPAT4、Akt3、DGK、GADD45G、HEXB、PIP5K、PLPP1、PRKAA、ST3GAL1、SKP2、SYK、FBXL1、AMPK、HSPA8。金定鸭与莆田黑鸭比较组中显著富集通路有6条，涉及17个候选基因，找到2个功能基因，主要参与淀粉和蔗糖代谢等通路，为ENPP1_3、FSHB。金定鸭与山麻鸭比较组中显著富集通路有14 条，涉及47 个候选基因，有8 个可能涉及重要经济性状，主要集中在沙门氏菌感染、癌症中转录失调、趋化因子信号通路等，为CCL4、CCL5、MAP2K1、GADD45、CXCL8、IL8、MEK1、PLOK。除此之外，对P 值作校正处理得到q值，挑选q值前20 通路，绘制气泡图（见图5）。

图5 KEGG富集分析气泡图Fig.5 KEGG enrichment analysis of candidate genes

3 讨论与结论

遗传分化由长期自然选择和人工选择造成，受群体交配、地域历史和基因流等因素影响。Wright认为当Fst＞0.25时表明群体间遗传分化程度较大[18]。本研究中，群体间Fst 值均大于0.25，说明金定鸭与连城白鸭、莆田黑鸭、山麻鸭间遗传出现高度分化。金定鸭是我国优秀地方蛋鸭品种，与其他3个地方品种相比，因受选择强度和方向不同，金定鸭在外貌特征、生产性能等方面均与其他地方品种存在差异。通过对金定鸭与其他3个地方群体之间选择信号检测，寻找与金定鸭重要经济性状相关的受选择基因。

与连城白鸭相比，金定鸭体型大且产蛋量高。Akt3 基因编码丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（蛋白激酶B）是PI3K-Akt 信号通路中重要基因，具有促进细胞增殖和调控细胞代谢等功能，与肌肉发育存在密切联系。王利娜研究发现，该基因正向调控家兔骨骼肌增殖发育，是影响生长速度重要基因[19]；陈亚楠认为其参与调控大白猪肌肉发育过程且对脂肪沉积有影响[20]；张荣萍检测到Akt在鸭胚后期高度表达，调控胸肌和腿肌发育[21]。研究发现该基因于多条通路中显著富集，提示金定鸭可能在肌肉生长发育过程受到选择。生长停滞和DNA损伤诱导基因（GADD45G）是GADD45家族成员，通常在胎盘中高度表达，与动物生殖密切相关。Liu等认为GADD45G基因可能是提高母猪产仔数的有用候选基因，暗示金定鸭在产蛋性能上受选择[22]。HSPA8 基因是热休克蛋白70 家族成员，该家族包含热诱导和组成表达的成员，Shigehisa等从珍珠鸡中鉴定出热休克蛋白（HSP）70 家族3 个基因同源体，其中HSPA8 禽同源基因为NmHSPA8[23]；热休克蛋白可在高温环境时保护机体免受损伤，该基因受强烈选择，与金定鸭具有较强耐热特性一致，可能与适应野外放养高温环境有关。PLPP1是研究人员近年确定的一类中性脂肪代谢调控关键基因，该基因编码蛋白质是磷脂酸磷酸酶（PAP）家族成员中3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPs），将磷脂酸转化为甘油二酯，并在甘油合成和磷脂酶D介导的信号转导中发挥作用，这种酶与水解和吸收胞外脂肪有关[24]，与之功能相近基因还有AGPAT4、DGK。与连城白鸭相比，金定鸭可能在肌肉生长发育、产蛋性能、热应激和脂肪代谢等方面受到选择。

金定鸭与莆田黑鸭组显著富集候选基因中，ENPP1_3、FSHB可能对重要经济性状有影响。ENPP1_3是外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP）家族成员，编码一种II 型跨膜糖蛋白，Trapero 等发现ENPP1 是子宫内膜异位症候选生物标志物[25]；Boggavarapu 等证实ENPP3 对孕激素具有调节作用[26]。FSHB基因编码促卵泡素β亚基，可诱导卵子和精子产生，Liu 等发现FSHB基因可促进北京鸭和黑番鸭产蛋，与GADD45G基因功能相近[27]。这些基因在金定鸭中受到选择，可能与其产蛋量性状相关。此外，试验发现在与莆田黑鸭比较中，筛选到受选择功能基因较少，因两者群体间遗传分化指数相对较小，金定鸭与莆田黑鸭可能具有更近血缘。

在筛选金定鸭和山麻鸭候选基因时发现，受选择基因（CCL4、CCL5、IL8等）大多与免疫功能有关，提示金定鸭在抗病性状上受强烈选择。CCL4、CCL5 同属于CC 趋化因子家族，参与动物免疫调节和炎症过程，Farhanah等研究发现，强毒力传染性法氏囊病病毒（vvIBDV）感染鸡，其机体CCL4、CCL5等免疫基因表达均上调[28]。IL8基因编码CXC 趋化因子家族成员，是炎症反应主要介质，编码蛋白质通常称为白细胞介素8；Kaiser 等发现鸡体内IL8的同源基因为9E3[29]；Ronan 等认为细菌入侵时IL8基因在机体肠道高表达是固有的免疫反应，在预防疾病中发挥重要作用[30]。

在3组显著富集功能基因中，并未发现选择清除分析中受重复选择的基因，表明受重复选择基因可能不直接参与功能通路对机体调控，具体作用方式和分子机制还需进一步研究。

综上所述，本研究采用简化基因组测序手段检测金定鸭选择信号。通过3组分析，分别注释得到349、185、316 个候选基因，其中有17 个落入重叠选择信号区域。在候选基因功能显著性富集分析中，功能基因提示金定鸭在产蛋性能、肌肉生长发育、免疫、热应激、脂肪代谢等方面受选择。研究结果将有助于金定鸭表型变异遗传剖析，并指示其进化方向。