Microcystin-LR对体外牛子宫内膜上皮细胞增殖和凋亡的影响

张贵学，李晓宇，黄富硕，马铭钧，王子铭，冯 瑞，李玉龙，许钟峯，郑 鹏

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

微囊藻毒素（Microcystin，MC）作为一种由水华爆发时微囊藻属等蓝藻产生的代谢产物[1]，已成为广泛存在于水体的有害物质。其中，变异体MC-LR（L，R 分别代表亮氨酸和精氨酸）分布最广，毒性最强[2]。近年来对MC-LR 研究日益深入，发现其对动物肝、肾脏、神经、免疫系统和生殖系统均具有毒性[3-4]。Campos 等研究表明，MC-LR 可通过转运蛋白有机阴离子转运多肽（OATP）承载进入细胞[5]，动物肝脏中存在OATP家族成员，是MC-LR 主要靶器官。向小鼠腹腔内注射用同位素标记的MC-LR 后，不仅在肝脏中检测到MC-LR 大量积累，且肾脏中也有分布[6]。此外，MC-LR 也可通过OATP 进入小鼠脑细胞，诱导小鼠海马神经元细胞（HT-22 细胞）产生氧化应激，引起神经细胞凋亡[7]。近年报道表明，MC-LR可减少淋巴细胞增殖，改变吞噬细胞（Phagocyte）和自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK）等活性，干扰细胞因子合成等多种机制改变免疫系统，对动物免疫系统产生不利影响[8]。MC-LR 除上述毒性外，对雌性动物生殖系统也有毒性。Zhang等研究MCLR 对体外中国仓鼠卵巢（CHO）细胞影响发现，MC-LR可显著抑制CHO细胞体外增殖，MC-LR处理的CHO细胞显示强烈细胞周期停滞及凋亡诱导作用；此外，将CHO 细胞暴露于MC-LR 导致过量活性氧生成和细胞内钙释放，导致内质网应激（ERs），同时自噬泡也大量积累[9]。Wu 将MC-LR以200 μg·kg-1剂量注射雌性小鼠腹腔内，连续28 d饲养，表明MC-LR 注射组小鼠卵巢重量较正常组下降，发情期和发情期持续时间减少，孕酮水平显著降低[10]。尽管之前有MC 对母畜生殖系统产生毒性作用的研究，但大多数集中在卵巢，关于MC对母畜子宫影响的研究却鲜见报道。因此，本试验旨在通过用MC-LR 体外处理牛子宫内膜上皮细胞（Bovine endometrial epithelial cells，BEECs），探究其对细胞活率影响及分子调控机制，为后续提高奶牛繁殖效率相关研究提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛子宫内膜上皮细胞购自广州华拓生物科技有限公司（Otwo Biotech）。

1.2 主要试剂

EMEM 培养基（购自美国Gibco 公司）；胎牛血清（Pansera ES）（购自德国Pan Seratech 公司）；PBS（P1010）、SDS-PAGE 电泳液（购自Solarbo 公司）；胰蛋白酶、胰酶细胞消化液、1.5 mol·L-1Tris-HCl（pH=8.8）、1.0 mol·L-1Tris-HCl（pH=6.8）、ECL 发光底物试剂盒、四甲基乙二胺（TEMED）和双抗均（购自奥淇洛谱（biosharp）公司）、微囊藻毒素（MC-LR）（购自MedChemExpress 公司）；β-actin、Caspase-3、Caspase-9 抗体以及其二抗均（购自博奥森（Bioss）公司）；Trizol、PCR试剂盒和反转录试剂盒均（购自日本TaKaRa公司）；TAE电泳液（购自纳川生物技术公司）；琼脂糖（购自Biowest 公司）；引物由上海生工生物科技公司合成；q-PCR 试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）（购自Roche 公司）；Cell counting kit-8（CCK-8）（购自美国Bimake 公司）；凋亡免疫荧光试剂盒（购自Beyotime Biotechnology 公司）；流式测细胞周期试剂盒（购自杭州联科生物技术股份有限公司）；流式测细胞凋亡试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 BEECs的培养

①细胞传代：参照詹同彤等方法[11]，将培养瓶中细胞转移到大皿中培养，待皿中细胞汇合到80%~90%时，用移液器吸出培养液，选择3 mL 1×PBS 清洗皿表面，加入4 mL 胰酶细胞消化液，放入37 ℃恒温培养箱中消化3~4 min，显微镜下观察细胞，待细胞变圆、漂浮后加入等体积培养液终止消化，用移液器轻轻吹打，将混合液移入10 mL离心管，用1 000 r·min-1离心机离心4 min，离心完毕后立即倾倒上清，然后向离心管中加入2 mL 培养液，吹打均匀后，分别移至两个中皿，再向两个中皿分别加入2 mL 培养液，细胞继续生长。待贴壁细胞数量达到80%~90%时，再次传代。

②细胞冻存和复苏：待细胞传至2~3 代时，冻存部分细胞供后续试验使用。按照细胞传代步骤至离心完毕倾倒上清后，向离心管中加入冻存液，待管中细胞充分溶解于冻存液后，移至2 mL冻存管中，用封口膜将冻存管口封好，放入4 ℃预冷30 min，-20 ℃中停留2 h，-80 ℃冻存柜中过夜。第二天将冻存柜中细胞移入液氮（-196 ℃）中长期保存。细胞复苏时，从液氮中取出冻存细胞，迅速放入37~38 ℃水浴锅中解冻，待冻存管中液体融化后，用移液枪将液体移至离心管中，1 000 r·min-1离心机离心3 min，弃上清后加入培养液溶解，溶解后将液体移入中皿，加适量培养液稀释，置于5%CO2箱，37 ℃，饱和湿度培养。

1.4 CCK-8检测细胞存活率

将细胞传至3~4代后，移至96孔板，培养24 h后，移液枪吸走上清，加入新培养液，分为10组，分 别 用0、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μg·L-1的MC-LR 处理细胞，培养12、24 h 后，加入CCK-8 试剂，继续培养2 h，之后用酶标仪测定450 nm 处吸光度，计算细胞存活率。

1.5 流式细胞术测定细胞凋亡率

待细胞传至3~4代，用160 μg·L-1MC-LR处理细胞24 h，培养至处理时间后弃掉培养液，用2 mL 1×PBS 清洗，用不含EDTA 的胰酶消化细胞，待皿中细胞被消化漂浮起来后收集细胞，用1 000 r·min-1、4 ℃离心机离心5 min，弃上清。预冷PBS洗涤细胞两次，均在1 000 r·min-1、4 ℃条件下离心5 min，弃上清。然后加入100 μL 1×Binding Buffer，轻轻吹匀直至成为单细胞悬液。之后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI Staining Solution，轻轻吹匀；避光、室温（20~25℃）孵育10 min；最后加入400 μL 1×Binding Buffer，轻轻混匀。染色后样品在1 h内用流式细胞仪检测。

1.6 流式细胞术检测细胞周期

收集用100 μg·L-1的MC-LR 处理12 h 后细胞（2×105~1×106个），离心弃上清，用1×PBS 洗涤一次，离心弃上清。然后加入1 mL DNA Staining solution 和10 μL Permeabilization solution 旋涡振荡5~10 s混匀。室温避光孵育30 min。选择最低点上样速度，在流式细胞仪上检测。

1.7 RT-qPCR检测基因mRNA表达

收集不同处理条件下细胞后，使用Trizol 提取RNA，紫外分光光度法测定其浓度和纯度。当OD260/OD280比值在1.8~2.0，认为样品合格。之后用TaKaRa 试剂盒进行反转录。待反转录完成后，再按照试剂盒步骤进行PCR 扩增。其中引物见表1，扩增完毕后，以β-actin 为参照，采用2-ΔΔCt方法计算各基因mRNA表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 Western blot 测定Pi3k、Akt、Caspase-9 和Caspase-3蛋白表达

收集经不同方案处理细胞后，用RIPA 裂解细胞获得蛋白。BCA 法确定蛋白浓度后，进行十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺电泳。之后转膜，脱脂乳封闭，4 ℃一抗孵育过夜，16 h后TBST清洗三次后室温孵育二抗，孵育完毕后再用TBST 清洗三次，清洗后加ECL 显色液曝光。以β-actin 为参照，使用Image J软件分析光密度。

1.9 统计学分析

试验重复3次，数据表示为平均值（Means）±标准差（SD），使用SPSS 20.0 软件统计分析，单因素方差分析LSD 法检验显著性，使用GraphPad Prism 8 软件制图，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 CCK-8检测不同浓度及时间处理后细胞存活率变化

CCK-8检测细胞存活率，结果见图1，12 h处理组，MC-LR 处理后细胞存活率增加；24 h 处理组，MC-LR 处理后细胞存活率降低。根据已有结果选取12 h 100 μg·L-1（P＜0.01），24 h 160 μg·L-1（P＜0.01）两种方案作后续试验。

图1 不同浓度、不同时间MC-LR处理对细胞存活率的影响Fig.1 Effects of MC-LR treatment at different concentrations and different times on cell viability

2.2 100 μg·L-1 MC-LR处理细胞12 h的影响

2.2.1 100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 h 后对Pi3k信号通路的影响

qPCR 检 测Pi3k、Akt、mTOR等mRNA 表 达量，结果见图2，与对照组相比，上述基因mRNA表达极显著上升（P＜0.01），表明使用100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 h 促 进Pi3k，Akt和mTOR的mRNA表达。此条件对Pi3k和Akt蛋白表达的影响见图3A，使用100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 h，Pi3k（110 ku）和Akt（56 ku）蛋白表达量均显著上升，其中Pi3k 蛋白表达量见图3B，表达量极显著上升（P＜0.01），Akt蛋白表达量见图3C，表达量显著上升（P＜0.05），与qPCR结果趋势一致。此试验结果表明用100 μg·L-1MC-LR处理细胞12 h，可强化Pi3k-Akt-mTOR通路导致细胞增殖。

图2 12 h 100 μg·L-1处理对Pi3k信号通路基因的影响Fig.2 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on Pi3k signal pathway genes

图3 12 h 100 μg·L-1处理对Pi3k及Akt蛋白的影响Fig.3 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on Pi3k and Akt protein

2.2.2 100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 h 后对线粒体凋亡通路的影响

100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 h 细胞线粒体凋亡通路相关基因mRNA 和蛋白相对表达量变化见图4，其中Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的mRNA 表达量与对照组相比均极显著下降（P＜0.01）；蛋白表达量条带结果见图5A，Caspase-9（35 ku）和Caspase-3（28 ku）表达均下降，Caspase-9蛋白表达结果见图5B，表达量显著下降（P＜0.05），Caspase-3蛋白表达结果见图5C，表达量极显著下降（P＜0.01）。以上试验结果表明，使用100 μg·L-1MC-LR处理细胞12 h，细胞线粒体凋亡通路被抑制，导致凋亡细胞数量减少，细胞数量增加。

图4 12 h 100 μg·L-1处理对线粒体凋亡通路基因mRNA的影响Fig.4 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on the mRNA of mitochondrial apoptosis pathway genes

图5 12 h 100 μg·L-1处理对Caspase-3和Caspase-9蛋白的影响Fig.5 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on Caspase-3 and Caspase-9 proteins

2.2.3 100 μg·L-1MC-LR处理细胞12 h对细胞周期的影响

100 μg·L-1MC-LR处理细胞12 h，细胞周期发生变化见图6A，处理后处于G0/G1 期细胞比例减少，G2/M期细胞比例增加，S期细胞比例增加，且根据图6B结果，其变化均呈极显著趋势（P＜0.01）。结果表明，100 μg·L-1MC-LR处理细胞12 h后，细胞处于G2/M期比例增加，有助于细胞增殖。

图6 12 h 100 μg·L-1处理对细胞周期的影响Fig.6 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on cell cycle

2.2.4 100 μg·L-1MC-LR处理细胞12 h后对p53基因mRNA表达的影响

100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 hp53 基因mRNA相对表达量变化如图7所示，p53基因mRNA表达量显著上升（P＜0.05）。

图7 12 h 100 μg·L-1处理对p53基因mRNA表达量的影响Fig.7 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on the expression of p53 gene mRNA

2.3 160 μg·L-1 MC-LR处理细胞24 h的影响

2.3.1 160 μg·L-1MC-LR处理细胞24 h后染色情况

160 μg·L-1MC-LR 处理细胞24 h 引起细胞变化结果如图8所示，染为绿色的为凋亡细胞，染为红色的为坏死细胞，其中黑色箭头指的是被绿色单染的凋亡细胞，白色箭头指示被绿色和红色双染的坏死细胞。统计分析表明160 μg·L-1MC-LR处理细胞24 h，引起细胞凋亡，且发现因凋亡死亡细胞数量大于坏死细胞数量。

图8 24 h 160 μg·L-1处理后细胞染色结果Fig.8 Cell staining results after 24 h 160 μg·L-1 treatment

2.3.2 160 μg·L-1MC-LR处理细胞24 h后对细胞凋亡率的影响

为进一步探究160 μg·L-1MC-LR 处理细胞24 h对细胞凋亡率的影响，采用流式细胞仪检测处理后细胞凋亡变化，结果如图9A 所示，细胞发生凋亡，且大部分凋亡细胞处于凋亡早期阶段。凋亡率如图9B 所示，与对照组相比，表达量极显著上升（P＜0.01）。

图9 24 h 160 μg·L-1处理对细胞凋亡率的影响Fig.9 Effects of 24 h 160 μg·L-1 treatment on cell apoptosis rate

2.3.3 160 μg·L-1MC-LR 处理细胞24 h 后对线粒体凋亡通路的影响

检测160 μg·L-1MC-LR 处理细胞24 h 线粒体凋亡途径主要基因变化见图10、11。图10 表明，160 μg·L-1MC-LR 处理细胞24 h后与对照组相比，Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2 基 因mRNA 相对表达量均上升，其中Cyt-c与Caspase-9显著升高（P＜0.05），Caspase-3、Bax/Bcl-2极显著升高（P＜0.01）。图11A蛋白条带结果显示，160 μg·L-1MC-LR 处理细胞24 h，与对照组相比，Caspase-9（35 ku）和Caspase-3（28 ku）蛋白表达量均升高，其中Caspase-9 表达量显著升高（P＜0.05），Caspase-3表达量极显著升高（P＜0.01），见图11B、11C。基因mRNA和蛋白表达趋势一致，试验表明，160 μg·L-1MC-LR处理细胞24 h，强化线粒体凋亡通路，导致细胞发生凋亡。

图10 24 h 160 μg·L-1处理对对线粒体凋亡通路基因mRNA的影响Fig.10 Effects of 24 h 160 μg·L-1 treatment on mitochondrial apoptosis pathway gene mRNA

图11 24 h 160 μg·L-1处理对Caspase-9及Caspase-3蛋白的影响Fig.11 Effects of 24 h 160 μg·L-1 treatment on Caspase-9 and Caspase-3 protein

3 讨 论

3.1 MC-LR处理对Pi3k通路的影响

研究证明Pi3k-Akt-mTOR 信号通路与细胞增殖联系密切[5-6]，细胞接收外界刺激后，可通过磷脂酰肌醇三激酶（Pi3k）诱发三磷酸（3,4,5）磷脂酰肌醇（PIP3）生成，生成的PIP3 可作为具有普列克底物蛋白同源性（PH）结构域蛋白质膜停泊位点，与Akt 及其上游激活剂PDK1结合[7]。当Akt 通过其普列克底物蛋白同源（PH）结构域与PIP3 结合后，导致Akt 转位至细胞膜，通过双磷酸化机制激活Akt。同理，自身PH 结构域而转位至细胞膜的PDK1 激活Akt 苏氨酸308 位点使其磷酸化。此外，mTORC2 可激活Akt 丝氨酸473 位点使Akt 酶活性被完全激活[8-10]。Pi3k 相关激酶（Pikk）家族成员，包括DNA-PK 也同样在Akt 丝氨酸473 位点将其磷酸化[7]。被激活的Akt 导致大量下游底物磷酸化，包括共有序列RXRXXS/T，其主要功能之一是调控mTOR 信号转导通路，促进细胞生长与蛋白质合成，从而达到细胞增殖目的[12-13]。本试验使用100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 h，Pi3k和Akt的mRNA 和蛋白相对表达量均显著上调，mTOR的mRNNA 表达量显著上调，证明此处理条件可激活细胞内Pi3k-Akt-mTOR 信号通路，引起细胞增殖，导致细胞数量增加。

3.2 MC-LR处理对线粒体凋亡通路的影响

线粒体是生命体中必不可少的一部分，主要参与ATP 合成，为细胞各种生命活动提供能量。Hers 等研究发现，线粒体在细胞凋亡过程中也扮演重要角色[14]。当细胞受到辐射、缺氧、毒素等外界应激时，线粒体外膜通透性（MOMP）发生改变，导致线粒体膜空间蛋白（尤其是细胞色素c）释放到细胞质中，激活胱天蛋白酶。胱天蛋白酶一旦被激活，裂解数百种蛋白质，导致细胞快速死亡，且这些死亡细胞具有独特生化和形态特征[15]。在线粒体ATP生成过程中，细胞色素c可在电子传输链的配合物Ⅲ和Ⅳ之间穿梭电子，但进入到细胞质后，就会在三磷酸腺苷（ATP）作用下与衔接蛋白凋亡酶激活因子（aPoPtotic Protease activating factor-1，APaf-1）结合，导致APaf-1 发生别构效应被激活[16]。APaf-1上有和Caspase-9同源的Caspase激活与募集结合域（CRAD），所以激活后APaf-1 会与Cyt-c、Caspase-9结合形成凋亡小体，且在其形成过程中完成对Caspase-9的募集和激活。激活后的Caspase-9会进一步激活其下游信号分子Caspase-3启动凋亡程序，最终引起细胞凋亡[17-19]。本试验中，使用100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 h 后抑制基 因Cyt-c、Caspase-9 和Caspase-3 的mRNA 以及Caspase-9和Caspase-3蛋白表达，从而抑制细胞凋亡。这种抑制作用可能是通过Cyt-c间接抑制线粒体下游途径[20-21]，也可能通过ATPase结构域直接和APaf-1 结合，阻碍ProcasPase-9 募集，抑制Caspase 级联反应，保护细胞免受Caspase-3 诱导表达[22]。而用160 μg·L-1MC-LR处理细胞24 h后促进Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2 基 因mRNA 和Caspase-9、Caspase-3 蛋白表达，进而导致细胞发生凋亡。

3.3 MC-LR处理对细胞周期及基因p53的影响

细胞周期变化直接影响细胞数量变化，通过对S 期细胞比率（S-Phase fraction，SPF）和增殖指数（Proliferous index，PI）计算可了解细胞增殖能力[23]。计算公式为SPF=S/（G0/1+S+G2/M）×100%，PI=（S+G2/M）/（G0/1+S+G2/M）×100%。本试验中，与对照组相比，经12 h 100 μg·L-1MC-LR 处理后细胞处于G0/G1 期数量显著下降，处于G2/M和S期细胞数量显著增加，SPF和PI值均增大，表明此处理条件使细胞周期发生变化，促使细胞发生增殖效应，导致细胞数量增多。

试验结果表明，用100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 h 后，细胞可通过Pi3k-Akt-mTOR 通路获得持续增殖信号，并且阻滞线粒体通路程序性细胞凋亡，此现象具有“肿瘤表征”，所以处理后导致细胞出现癌变趋势。p53基因作为抑癌基因，在抑制细胞癌变方面扮演重要角色。在细胞周期中，p53 调节功能主要体现在G1 和G2/M 期监测校正点，与转录激活作用密切相关。p53 还可通过与p21 和GADD45结合形成复合物，利用自身3'~5'核酸外切酶活性，在DNA 修复中发挥作用。正常情况下，p53 基因对细胞周期有“减慢或监视”作用。细胞中抑制癌变的基因p53 可判断DNA 变异程度，如变异程度较小，p53促使细胞自我修复，使其发挥正常功能。若DNA 变异较大，p53 诱导细胞凋亡[24]。本试验检测p53 基因在用100 μg·L-1MC-LR处理12 h 条件下mRNA 相对表达量，结果显示其相对表达量显著上升，因此认为该处理使细胞发生变异，但因变异程度较小而未产生凋亡效果。

4 结 论

综上所述，100 μg·L-1MC-LR 处理细胞12 h，细胞通过增强Pi3k-Akt-mTOR 信号通路和抑制线粒体凋亡通路促进细胞增殖，导致处于G1期细胞数量减少，G2/M 和S 期细胞数量增加；160 μg·L-1MC-LR 处理细胞24 h，细胞通过活化线粒体凋亡通路发生凋亡。