米托蒽醌抑制USP11促进BACE1降解延缓阿尔茨海默病发展的实验研究

吴昌安，曹岐新，艾宗耀

(浙江中医药大学附属湖州中医院 神经内科，浙江 湖州 313000)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统进行性退行性疾病，发病机理仍不明确，有研究认为β-分泌酶(BACE1)可能是治疗AD的重要靶标。蛋白质的降解主要通过泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system, UPS)，蛋白质在泛素化修饰中调整细胞生理生化功能，去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)保护靶蛋白不被水解。泛素化特异性蛋白酶11(USP11)是DUBs成员之一，可调节胞内多种蛋白的活性，在多种疾病的发生发展中起着重要作用。

米托蒽醌(Mitoxantrone，MTX)是一种蒽环类广谱化疗药，目前临床上主要用于治疗急性髓系白血病等恶性肿瘤。研究发现MTX可作为USP11的小分子抑制剂，能够特异性抑制USP11的活性。本文通过AD细胞模型，研究MTX对AD的治疗作用及可能的机制，以期为开发治疗AD药物提供新的作用靶点与理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 米托蒽醌(Mitoxantrone，美仑公司，批号：MB1404)；ELISA检测试剂盒(美国Abnova公司，批号：KA1158)。高尔基试剂盒(美国hitobiotec 公司，批号：HTKNS1125)；本实验所需抗体购自美国Proteintech公司；水迷宫系统购自上海移数。实验所需细胞株H4来源于本院菌种保藏中心。

1.2 细胞培养 从-80 ℃冰箱取出H4细胞，复苏操作后转移至含有10 mL已预热DMEM完全培养基的10 cm培养皿中，置于37 ℃含5%CO的恒温细胞培养箱中培养。待其密度达到80%～90%时，进行传代培养，传代比例为1∶9。

1.3 USP11-siRNA合成及转染 按照siRNA靶点的设计规则，根据USP11的序列，利用Invitrogen公司的设计软件，设计USP11的siRNA及对照序列，USP11的对照序列及siRNA序列由上海吉玛科技有限公司合成，分别命名为NT-siRNA、USP11-siRNA。取复苏后H4细胞，待其达到70%～80%密度后，将合成的NT-siRNA、USP11-siRNA按照脂质体试剂说明操作经Lipofectamine 2000转入H4细胞中。转染后细胞分别命名为NT siRNA组、USP11 siRNA组。

1.4 免疫印迹法(WB)检测目的蛋白 从细胞培养皿上刮下细胞，滴加蛋白裂解液，并超声破碎后静置30 min，4 ℃下离心12 000 r/min 25 min，留取上清。测定蛋白浓度后制成等蛋白浓度的样品。聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，而后电转PVDF膜，脱脂牛奶封闭2 h后，分别与特异性一抗GAPDH(1∶3 000)、USP11(1∶500)、BACE1(1∶800)、ADAM10(1∶800)以及PS1(1∶800)在4 ℃下孵育过夜，而后二抗(1∶3 000)孵育2 h，暗房显色。Image J图像分析软件分析各条带的吸光度值，以目的蛋白对GAPDH 相对值计算结果,各标本重复3次。

1.5 免疫共沉淀检测USP11和BACE1之间调控作用 将细胞裂解，制成等体积等质量样品后置于EP管，利用免疫共沉淀技术(Co-IP)，采用WB检测USP11和BACE1水平。构建USP11-HA过表达质粒，转染至H4细胞中，再次利用Co-IP，使用HA标签抗体免疫共沉淀等量的BACE1，采用WB检测BACE1蛋白上所连接的泛素蛋白Ub表达水平，观察USP11对BACE1蛋白进行泛素化蛋白酶体降解的影响。

1.6 实验动物和分组 SPF级C57BL/6J小鼠8只与5×FAD小鼠16只，雄性，20周龄，体质量30～35 g，购于上海南方模式生物科技股份有限公司(合格证号:312024300000732)。其中C57BL/6J小鼠为对照组(Ctrl组)，5×FAD小鼠(AD组)分为2组各8只，分别给予等剂量PBS腹腔注射(AD+PBS组)、等剂量MTX腹腔注射(AD+MTX组)，均于训练前3天开始腹腔注射，连续3 d。

1.7 水迷宫实验

1.7.1 训练期 将小鼠头朝池壁放入水中，记录小鼠找到平台的时间，让小鼠在平台上停留10 s。每只小鼠每天训练4次，连续训练5 d。

1.7.2 测试期 最后一次训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60 s的探查训练。将小鼠由原先平台象限的对侧放入水中。记录小鼠找到目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

1.8 小鼠脑组织检测 水迷宫实验后，各组小鼠断头取脑，剥离海马，取适量海马组织匀浆，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min取得待测样本，利用Westen blot检测小鼠脑组织中USP11、BACE1的表达水平，ELISA检测Aβ蛋白含量。然后通过高尔基染色(按高尔基染色试剂盒说明书操作)，显微镜下(×100)观察和统计小鼠海马中突触的密度(10 μm长度的树突的突触数量)。

1.9 统计方法 应用SPSS 21.0处理数据，采用检验和方差分析。<0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 H4细胞中USP11、BACE1的表达水平 USP11-siRNA处理后，H4细胞中USP11、BACE1的表达水平分别为(0.300±0.114)和(0.267±0.125)，与NT siRNA组差异有统计学意义(<0.01)。ADAM10、PS1表达水平分别为(0.933±0.249)、(1.130±0.175)，与NT siRNA组的差异均无统计学意义(>0.05)，见图1。

注：1) 与NT siRNA组比较，P<0.01。

2.2 USP11与BACE1之间存在的调控作用 IP检测结果显示，USP11可以免疫共沉淀下BACE1，同样的BACE1也可以免疫共沉淀下USP11，见图2A。蛋白泛素化检测结果如图2B所示，过表达USP11的H4细胞中，BACE1蛋白上所连接的泛素蛋白Ub的相对表达量为(0.3±0.141)，明显低于NT siRNA组，差异具有统计学意义(=1.8，<0.01)。

注：1) 与NT siRNA组比较，P<0.01。

2.3 小鼠在水迷宫中寻找平台的时间 水迷宫实验发现，小鼠注射MTX后初期寻找平台所需时间为(93±2.16)s，训练5 d后为(38±2.87)s；AD+PBS组小鼠初期寻找平台所需时间为(87±4.03)s，第5天为(57±2.05)s；2组差异有统计学意义(=1.947,<0.01)。对照组小鼠训练第1天和第5天寻找平台所需时间分别为(61±1.25)s、(11±2.94)s，见图3。

注：1) 与AD+PBS组比较，P<0.01。

2.4 各组小鼠海马中USP11、BACE1、Aβ的表达水平 Westen blot检测显示，MTX组的UPS11、BACE1蛋白的相对表达量分别为(0.22±0.09)、(0.18±0.10)，ELISA检测Aβ蛋白含量为(30.25±3.56)pg/mL，相对于对照组，AD+MTX组中UPS11、BACE1、Aβ的表达水平均明显下降，差异有统计学意义(<0.01)，见图4。

注：1) 与对照组比较，P<0.01。

2.5 小鼠海马中突触的密度 通过高尔基染色可以发现，AD+MTX组和AD+PBS组小鼠海马中突触的密度分别为(9.0±0.71)个/10 μm、(5.75±1.09)个/10 μm，2组差异有统计学意义(=2.375，<0.01)。对照组小鼠中，注射MTX和注射PBS的小鼠间海马突触密度差异无统计学意义(=0.4198)，见图5。

注：1) 与对照组比较，P<0.01。

3 讨论

AD主要临床症状为进行性记忆力与认知能力的减退，并发言语功能障碍或精神运动异常等，对患者及家属乃至社会带来沉重的负担，但至今为止，其发病机制仍不明确。其中Aβ在脑神经细胞外的沉积是目前最被认可的假说，研究认为其在AD的病理生理进程中起到非常重要的作用。Aβ可内由β淀粉样前体蛋白(APP)经α-分泌酶(ADAM10)、β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶(PS1)水解后产生，并在大脑海马和皮层聚集、沉积形成Aβ斑块，最终导致神经系统的退行性病变。而BACE1是APP切割产生Aβ最关键的酶，被认为是治疗AD的重要靶标。

蛋白质降解的途径之一是UPS。可通过对蛋白质泛素化修饰,改变胞内蛋白质的稳定性，调节其定位或活性，从而影响蛋白的功能。泛素化特异性蛋白酶USP可逆转这一过程。其中USP11已被证实在多种疾病的发生发展中起着重要的作用。在本研究中，我们尝试构建USP11-siRNA敲低H4神经胶质细胞瘤中USP11的表达水平，并进一步检测其对APP水解酶ADAM10、BACE1与PS1的表达影响，发现敲低USP11可下调BACE1的表达，但对ADAM10与PS1没有影响，这说明，USP11与BACE1存在关联性，且相对特异。

为了进一步探讨USP11与BACE1之间的关系，首先我们应用IP的方法检测USP11与BACE1之间是否存在相互作用。实验结果发现，USP11与BACE1可相互沉降对方，说明两者之间存在直接的相互作用。但USP11到底是通过何种作用模式调控BACE1的表达还未知。现有研究表明：USP11是USP家族的一员，可对其靶蛋白去泛素化，从而抑制靶蛋白降解并稳定其的表达。例如：USP11能对IκBα去泛素化，通过稳定IκBα进而抑制TNFα介导的NF-κB的激活；另外USP11还可通过对ALK5去泛素化，同时参与调控SMAD2/3磷酸化和SMAD核转移，从而增强TGFβ通路的信号。因此，我们尝试在H4细胞中转染USP11-HA质粒以过表达USP11，并利用BACE1抗体免疫共沉淀下BACE1以分析BACE1蛋白上所连接的泛素蛋白，通过Westen blot的结果可知，过表达USP11后，BACE1蛋白上连接的泛素蛋白Ub明显下降。这说明USP11可与BACE1相互作用并对BACE1去泛素化。因此USP11有望成为治疗AD的潜在靶点。

现已有报道证实广谱化疗药米托蒽醌(MTX)可作为USP11的小分子抑制剂，且MTX现在已经投放临床，用于治疗多种肿瘤疾病，因此我们提出假设，MTX对AD存在治疗作用。由于MTX存在细胞毒性，我们应用最低有效浓度的MTX处理AD小鼠，发现AD小鼠海马中USP11与BACE1的表达均出现下降，进一步以ELISA检测Aβ的表达，发现Aβ的表达也出现下调，这与细胞实验中的结果一致。为此，我们推测MTX可改善AD小鼠的行为认知。为了验证这个假设，我们进一步以高尔基染色法与水迷宫检测MTX对AD小鼠海马组织与行为认知的影响，发现MTX可促进AD小鼠海马中突触的形成，并减少AD小鼠寻找平台的时间，这与细胞实验的结果与其所推测的假设一致。

综上，米托蒽醌MTX可通过抑制USP11进一步促进BACE1泛素化及降解，从而抑制Aβ的表达，并有可能进而达到对Aβ引起的神经退行性病变起到抑制或延缓作用，可为米托蒽醌临床应用于治疗AD病变提供实验依据。