新型通用型检测器-电喷雾检测器在药物分析中的应用进展

刘 菁，吴 燕

（天津市药品检验研究院，天津 300070）

目前，高效液相色谱法（HPLC）已成为制药研发、环境检测、化工化学、食品分析等多个领域应用最普遍的分析技术。检测器作为高效液相色谱的重要组成部分，其类型和性能决定被测化合物的响应值和干扰情况，是色谱方法建立初期应考虑的关键问题。近年来，电喷雾检测器（CAD）作为一种新型通用型检测器在多个检测分析领域的应用越来越广泛，应用CAD检测器进行药物分析检测的液相色谱法已被国外药典收载。例如《英国药典》2021年版（BP 2021）［1］和《美国药典》2021年版（USP 2021）［2］均采用CAD检测器对造影剂钆布醇的有关物质进行考查，同时USP43/NF38［3］中脱氧胆酸的含量测定也采用CAD检测器进行。现行的《中国药典》2020年版［4］首次在通则高效液相色谱法中提及CAD检测器并进行了简要介绍。本文在介绍CAD检测器原理、特点、优势的基础上，结合近年来国内外发表的相关文献，对CAD检测器在药物分析领域的应用成果作以总结，为无紫外吸收或弱紫外吸收物质的检验检测提供参考。

1 CAD检测器工作原理及特点优势

1.1 工作原理 当CAD检测器与HPLC联用时，HPLC洗脱液经与CAD检测器的雾化器中氮气碰撞而雾化，含有分析物的较小液滴在室温下干燥形成溶质颗粒，与带电氮气碰撞，使得分析物颗粒表面带上正电荷，经过带有低负电压的离子阱装置去除迁移率大的多余带电氮气，迁移率小的带电分析物颗粒把其电荷转移给一个颗粒收集器，最后通过一个高灵敏度的静电检测计测量分析物的电荷量并形成电信号，该信号强度与溶质质量成正比［5］。CAD检测器原理图见图1［6］。

图1 CAD检测器原理图

1.2 特点及优势 CAD检测器作为一种通用型检测器，适用范围广、灵敏度高、稳定性强、操作简便。相对于紫外及二极管阵列检测器（UV&DAD），CAD检测器的响应值不依赖于被测物质的化学结构，只与被测物质的进样质量有关，具有较高的响应一致性；虽然质谱检测器（MS）的应用也十分广泛，但应用MS作为检测器的前提是被测物质可以被电离，且其造价和维护维修费用都很昂贵；另一种通用型检测器示差折光检测器（RID）由于不能兼容梯度洗脱，且抗干扰能力较差，应用范围也很有限；相对同为通用型检测器的蒸发光散射检测器（ELSD），CAD检测器的线性范围通常可达3~4个数量级，检测灵敏度高，且CAD检测器的测定参数基本已在出厂时设定好，每次分析的条件相对固定，因此重现性良好［7］。CAD检测器虽具有明显优势，但在使用时还存在一定的局限，表现在由于被测物质随流动相进入检测器后需要先雾化再干燥形成溶质颗粒，所以流动相中不可使用不挥发的缓冲盐。

2 CAD检测器在药物分析中的应用

2.1 在中药分析中的应用 在中药饮片、中成药及天然产物的分析研究及质量控制中，被测物质常常不具备发色基团，紫外吸收极弱，甚至没有紫外吸收，如皂苷类、内酯类、糖类等化合物。胡瀚文等［8］建立了HPLC-CAD测定大叶三七叶中人参皂苷Rb1含量的方法，并与以DAD作为检测器的测定结果进行了对比，结果表明CAD检测器具有更稳定的基线和更高的灵敏度。刘可等［9］采用HPLC-CAD建立了一种准确、快速、高效的测定远志药材中细叶远志皂苷含量的方法，并对方法学参数进行了考查。南易等［10］建立了HPLC-CAD同时对知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ进行含量测定的方法，此前由于芒果苷和知母皂苷BⅡ的结构差异，知母中这两种成分要分别采用DAD和ELSD检测器进行测定。同时，在实验中发现CAD检测器的灵敏度明显高于ELSD检测器。沈建伟等［11］从溶剂补偿流速、柱温箱温度、雾化温度三个角度，对柱后补偿电喷雾检测器测定黄芪甲苷含量的方法进行了探索，最终确定最佳色谱条件为采用0.4 ml/min流速的乙腈进行补偿，同时将柱温箱温度设为30℃，雾化温度设为30℃。刘丽娜等［12］采用HPLC-CAD技术建立了同时测定银杏叶提取物中白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A和银杏内酯B含量的方法，所建方法各项方法学参数良好，与ELSD检测器、RID检测器的测定结果相比，CAD检测器的灵敏度最高。白钢钢等［13］采用HPLC-CAD法对银杏叶片、银杏叶分散片、银杏叶胶囊和银杏叶滴丸等18批银杏叶制剂中4种萜类内酯类成分的含量进行测定，该方法操作简便，灵敏度高，准确度、重复性均良好，各项方法学参数符合要求。王莹等［14］分别采用ELSD检测器、CAD检测器建立了注射用益气复脉（冻干）中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量测定方法，并对测定结果进行了分析。同时研究中发现，CAD检测器的功能参数（PF）是能否对糖类进行准确测定的关键参数。Hu等［15］建立了超高效液相色谱与CAD检测器联用方法（UPLC-CAD）用于同时测定太子参中7种低聚糖和蔗糖，该方法各项方法学参数良好。试验中还采用液质联用（UPLC-QTOF）技术对不同产地来源的太子参样品中所含低聚糖的种类进行了鉴定。Sebastian等［16］利用HPLC-CAD技术建立了测定欧洲龙牙草中14种多酚类物质的方法，并在试验中观察到CAD检测器在定量多酚类化合物的过程中存在一定的局限性，需要予以重视。方灵芝等［17］利用HPLC-CAD技术同时对儿童用中成药小儿解感片中7种黄酮类成分的含量进行测定，所建方法准确度高，重复性好，线性关系、回收率、精密度均符合测定要求。

CAD检测器具有宽动态检测范围、高灵敏度和稳定性等优点，可用于同时测定中性、酸性、碱性及两性物质［18］，因此常用于同一药材或成药中多种不同性质物质的同时测定。任霞等［19］采用HPLC-CAD建立了甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷及甘草酸4种成分的含量测定方法，4种成分的回收率均在97%以上，所建方法准确高效。罗昌明等［20］应用CAD检测器测定了中成药风湿定片中8种指标成分的含量，方法学实验表明所建方法准确性、重复性好，可操作性强，得到了满意的测定结果。

中药指纹图谱从“全成分”的角度出发进行中药的质量控制，是中药道地药材研究的重要手段，具有系统性、特征性等特点，而能否检出尽可能多的色谱峰是中药指纹图谱是否具有代表性的关键影响因素。由于CAD检测器具有响应一致性且灵敏度高，现已成为中药指纹图谱研究不可或缺的重要技术手段。Cao等［21］将UPLC-CAD技术应用于中成药滋肾育胎丸的指纹图谱及多成分分析研究，试验中选择了52个色谱峰作为特征峰用以评价16批滋肾育胎丸的相似性。该团队还利用超高分辨率质谱仪鉴定了滋肾养胎丸中的281种化合物的结构。张春泥等［22］利用HPLCCAD技术对20批不同来源、产地的川楝子饮片进行成分分析，确定了28个共有峰，并采用UPLC-QTOF质谱技术对其中6个色谱峰进行了指认和鉴定。通过与HPLC-UV及HPLC-ELSD获得的指纹图谱对比，发现CAD检测器的灵敏度更高，且所建方法的分离度及各项方法学参数良好。研究中采用聚类分析、主成分分析等统计学方法对获得的指纹图谱进行相似度评价，最终将20批样品分成三类。陈学松［23］利用HPLC-CAD技术建立了马鞭草指纹图谱的测定方法，确定了17个共有峰，并对其中的熊果酸峰、齐墩果酸峰进行了确认。试验中通过优化色谱条件使难分离的同分异构体熊果酸、齐墩果酸达到基线分离。2.2 在生化、化学、抗生素药物分析中的应用

2.2.1 在生化药物分析中的应用 Satoshi等［24］采用HPLC-CAD方法在低浓度范围内对未进行衍生化的19种氨基酸和牛磺酸进行了分离及含量测定。试验结果表明，在0.1～1.6 nmol范围内各组分线性关系良好，且方法重复性好、精密度高。羟甲司坦是一种用于治疗慢性阻塞性肺疾病及支气管哮喘的辅助用药，其结构可以看作是氨基酸的衍生物，因此羟甲司坦及其结构类似物在紫外检测器上响应强度很低。Oliver等［25］采用反相、阳离子交换混合模式与CAD检测器联用对羟甲司坦中的杂质进行了研究，所建方法在0.05%～0.25%和0.10%～0.60%范围内线性关系良好，检出限可达到0.03%以下。Daniel等［26］利用HPLCCAD技术对多聚唾液酸的链长进行了表征，并建立了多聚唾液酸的定量测定方法。该方法与传统的经衍生化处理荧光检测测定法比较，具有简便、快速的特点，且在0.025～15 mg/ml浓度范围内线性关系良好。Helen等［27］利用HPLC-UV-CAD联用技术对两种静脉注射脂质乳液型肠外营养液（PN）的化学稳定性情况进行了研究。试验中通过测定样品中甘油三酯和过氧化产物4-羟基壬烯醛的量来监测PN中脂质的降解情况，该方法的检出限、定量限、线性、日内及日间精密度等各项方法学参数均能满足测定要求。

2.2.2 在化学药物分析中的应用 有些化学药物结构中没有紫外吸收基团或在紫外检测器上仅有末端吸收，CAD检测器是对这类化学药物进行分析的重要手段。龙珍等［28］采用亲水色谱及CAD检测器建立了同时测定5种抗病毒药物的方法，并通过比较被测物质的峰型、分离选择性及信号响应，考查不同的色谱模式、检测方式对色谱系统的影响，所建方法实现了紫外吸收差异大、极性分布范围广的5种抗病毒药物的同时分析，且方法学参数良好。赵慧［29］建立了HPLC-CAD法测定阿卡波糖胶囊含量，克服了《中国药典》［30］中该品种的含量测定方法灵敏度低、基线不稳、氨基柱使用寿命短、柱效下降快、色谱峰峰形差等缺陷，并在试验中考查了采样频率和过滤常数、雾化温度、幂率等CAD检测器参数的改变对测定结果的影响。周洁等［31］建立了HPLC-UV-CAD联用同时测定卡前列素氨丁三醇注射液中主要成分含量的方法，试验中采用反相C18和阳离子交换混合模式的色谱柱，紫外检测器用于检测注射液中的苯甲醇，CAD检测器用于检测注射液中紫外吸收很弱或没有紫外吸收的组分卡前列素和氨丁三醇，方法灵敏准确、操作简便、专属性强。

某些化学药物的有关物质及降解产物不具备紫外吸收基团，仅采用常规的紫外检测器无法全面掌握药物的稳定性情况，CAD检测器的使用为此类问题提供了解决方案。Pramod等［32］建立了HPLC-CAD测定加巴喷丁及其有关物质的方法，经方法学验证各项方法学参数结果良好，且所建方法与HPLC-MS/MS可以良好兼容。该作者还利用HPLC-MS/MS对加巴喷丁的酸、碱、氧化、加热、光照等条件下的主要降解产物结构进行研究及确证。吴川彦等［33］通过对比DAD检测器与CAD检测器专属性试验结果，最终建立了HPLC-CAD测定伐地那非的含量及有关物质的方法，各项方法学参数良好。Oliver的科研团队［34］采用高效液相色谱与CAD检测器联用对伊班膦酸钠的杂质情况进行了研究，方法中应用了疏水C18与强阴离子交换的混合分离机制。所建方法各项方法学参数良好，多批次样品测定结果显示伊班膦酸钠中的主要杂质为合成的副产物。Xu等［35］采用亲水作用色谱柱及CAD检测器测定酒石酸美托洛尔注射液、酒石酸美托洛尔片和琥珀酸美托洛尔缓释片中美托洛尔降解产物3-异丙基胺基-1，2-丙二醇的量，经方法学验证，该方法具有良好的特异性、准确度和精密度。

CAD检测器的应用让使用更加绿色环保的有机溶剂如丙酮、乙醇作为流动相成为可能，Nevena等［36］以丙酮、乙醇为流动相建立了测定利司培酮及其有关物质的HPLC-CAD方法，试验中利用Derringer函数统计方法对试验条件进行筛选和优化，方法学验证试验表明所建方法符合测定要求。

2.2.3 在抗生素类药物分析中的应用 氨基糖苷类和大环内酯类药物均为常用的抗生素类药物，其结构中都不具备紫外吸收基团，难以使用常规的紫外检测器进行分析。在此类药物的定量测定、降解杂质及有关物质研究中，CAD检测器有着广泛的应用。刘照振等［37］建立了HPLC-CAD测定盐酸依替米星注射液中有关物质的方法，并将该方法与ELSD、脉冲安培电化学检测器（PAD）的测定结果进行了对比。结果表明采用CAD检测器，各色谱峰的分离度及检测灵敏度较ELSD高，各有关物质测定结果的准确性较PAD好。Arianne等［38］建立了阿米卡星的HPLC-CAD测定方法并进行了方法学验证，该方法简便快速，避免了常规方法中需进行柱后衍生的繁琐操作，可以达到每天测定近200个样品的通量。氨甲基膦酸是合成万古霉素衍生物特拉万星的一种关键中间体，但氨甲基膦酸紫外吸收较弱，无法采用常规的DAD检测器对其进行测定。顾海芳等［39］采用CAD检测器建立了氨甲基膦酸含量测定方法，并对所建方法的方法学参数进行了考查。

Liu等［40］利用HPLC-CAD技术建立了测定约沙霉素和麦迪霉素中多种组分的通用可靠的测定方法，试验中对高效液相色谱条件和CAD检测器参数均进行了优化，使各被测组分得到良好的分离和较高的检测灵敏度。所建方法各项方法学参数良好，且对于十六元大环内酯类抗生素的分析测定具有一定的通用性。Wang等［41］还建立了HPLC-CAD测定十六元大环内酯类抗生素白霉素、麦白霉素中降解杂质的方法，并分析了降解杂质产生的影响因素。利用CAD检测器的性能特点解决了不同降解产物因紫外吸收强度差异大而无法同时测定的问题，试验结果显示，被分析物在2～100μg/ml范围内线性关系良好，低、中、高三水平回收率在98.7%～102.5%，检出限、定量限分别为5 ng和15 ng，文中还考查了流动相中盐的浓度、pH值以及柱温对CAD检测器的信号的影响。

2.3 在药用辅料分析中的应用 药用辅料在药物制剂产生恰当的治疗作用过程中扮演着重要的角色，其质量控制也受到越来越多的重视。一般来讲，药用辅料尤其是小分子药用辅料的分子结构比较简单，常常不具备紫外吸收基团，使得应用如紫外检测器等常规检测方式对其进行分析十分困难。CAD检测器的应用为解决此类问题提供了一种思路。蔗糖、乳糖均为常用药物辅料，在制剂中作为赋形剂、矫味剂等。孙亚灵等［42］建立了蔗糖及其有关物质的HPLC-CAD测定方法，试验中考查了CAD检测器关键参数雾化温度、采集频率、过滤常数以及幂率对信号响应的影响。孙亚飞等［43］建立了HPLC-CAD测定乳糖含量及其有关物质的方法，方法学试验表明在1.0～100.4μg/ml范围内线性关系良好，检出限、定量限约为8 ng和20.08 ng。试验中还观察到所建方法较原方法色谱柱的耐用性有了很大提高。尿素作为药用辅料在制剂中主要作为透皮吸收剂及助溶剂。赵恂等［44］采用亲水作用色谱柱、CAD检测器建立了尿素含量及有关物质的测定方法，研究中利用所建方法对6批尿素样品进行了含量测定，并与凯氏定氮法的测定结果进行了比较。经方法学验证，所建方法各项方法学参数良好，操作简便，结果准确可靠。

磷脂及其衍生物由于其独特的特性，是脂质体药物传递系统的重要组成部分。Florian等［45］建立了超高效液相色谱DAD检测器、CAD检测器联用同时检测大豆来源的氢化L-α-磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱等22种天然及合成脂质、带电磷脂、亲脂荧光标记物及其降解产物的方法。所建方法各项方法学参数良好，研究者用该方法检测布比卡因脂质体的光降解情况。

表面活性剂是制药工业中常用的辅料种类，其中的非离子型表面活性剂常常为聚合物。由于聚合物往往不具备单一分子量，成分组成具有多分散性，要对此类物质进行量化，就需要具有响应一致性的通用型检测器，CAD检测器成为了很好的选择。Christiane等［46］利用HPLC-CAD方法对凝胶基质类乳化剂进行了研究，所建方法可以同时分离、分析13种凝胶基质类乳化剂及其前体化合物，如聚乙二醇、聚山梨酯、硬脂酸酯、聚氧乙烯醚。该方法重现性好、专属性高，同时与液质联用仪有很好的兼容性。Steffen等［47］在测定聚山梨酯20（PS20）、聚山梨酯80（PS80）及其降解产物含量时，研究比较了荧光胶束法、高效液相电喷雾检测法和高效液相蒸发光散射检测法等三种定量分析方法定量行为的差异。试验中发现由于三种测定方法的原理各不相同，对PS20、PS80及其降解产物的定量结果存在较大差异，同时由于PS80结构中疏水基团比例更高，使其定量准确度更加依赖于测定方法的选择。Alizee等［48］首先利用亲水色谱柱半制备色谱仪分离制备了11种非离子型表面活性剂聚氧乙烯脂肪醇醚的同系物，并利用CAD检测器测定其在100～500 mg/kg的浓度范围内标准曲线的斜率，用以研究CAD检测器在同系物检测中的响应一致性。试验结果显示在检测此类物质时，CAD检测器的响应一致性出现了偏差，研究者分析可能是受被测物质电离程度的影响，具体原因还需进一步研究。

CAD作为一种新型检测器在各类药物的分析研究领域发挥越来越多的作用，也逐渐被越来越多的研究人员熟悉，应用前景十分广阔。有研究［49］利用HPLC-CAD技术进行葡萄糖胺的人体药代动力学研究，CAD检测器灵敏度高的特性可以满足人体药代动力学研究的要求。在食品研究领域［50］，采用UPLCCAD技术通过测定橄榄油中三酰甘油的分布情况，结合统计分析方法来辨别特级初榨橄榄油中是否掺假，该方法相对于传统的脂肪酸和甾醇分析法既方便快捷又节约成本。虽然也有使用局限性的相关报道［48］，但CAD检测器仍是对多组分样品进行全面分析的重要补充手段，在药物分析领域也将发挥更大的作用。