水中叶绿素a 测定方法的比较研究

张 婧

（北京市朝阳区生态环境监测中心，北京 100125）

叶绿素是植物光合作用中的重要光合色素。通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水体的初级生产力情况。在环境监测中，可将叶绿素a 含量作为湖泊富营养化的指标之一[1]。近30年来，由于我国水环境的恶化，特别是水体富营养化问题，使得浮游植物叶绿素a 的测定被广泛地应用[2]。

目前本实验室测定叶绿素a 的方法为环境保护部发布的HJ 897—2017《水质 叶绿素a 的测定 分光光度法》[3]。该法使用90%丙酮作为提取试剂，丙酮试剂对人体危害较大且易挥发，在人工研磨过程中存在少量飞溅现象，对实验人员健康影响存在隐患，在反复研磨过程中叶绿素a 容易发生光降解[4-6]直接影响叶绿素a的测定结果；另一方面，不同材质滤膜的提取效率对叶绿素a 测定结果有直接影响。因此，本文通过手工研磨与仪器研磨方式、乙酸纤维滤膜与玻璃纤维滤膜进行了对比，经检验本文改进方法的实验结果符合标准要求，在一定程度上提高了叶绿素a 的检出效率。

1 方法与材料

1.1 方法标准及原理

目前测定地表水中叶绿素a 含量的标准方法是环境保护部于2017年12月21日发布的HJ 897—2017《水质 叶绿素a 的测定 分光光度法》[3]。标准方法原理是将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，再用丙酮溶液提取水中浮游植物的叶绿素，离心分离后分别于750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 波长处测定提取液吸光度值，根据公式计算水中叶绿素a的浓度。

1.2 材料与试剂

分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的超纯水，使用试剂及溶剂情况登记表见表1。

表1 使用试剂及溶剂情况登记表

材料及试剂配制如下。

（1）丙酮溶液：9+1

在900 mL 丙酮中加入100 mL 实验用水。

（2）碳酸镁悬浊液

称取1.0 g 碳酸镁加入100 mL 实验用水，搅拌成悬浊液（使用前充分摇匀）。

（3）玻璃纤维滤膜：孔径0.45～0.7 μm。

（4）乙酸纤维滤膜：孔径为0.45 μm。

1.3 仪器和设备

实验室现有仪器设备：紫外可见分光光度计（配10 mm 石英比色皿）、离心机（相对离心力1000×g，转速3 000 ～4 000 r/min）、组织研磨器、玻璃研磨器、配真空泵不锈钢溶液过滤器、0.45 μm 有机相针式过滤器等均符合方法要求，且仪器已检定/校准合格，并在有效期内，仪器使用情况见表2。

表2 使用仪器情况登记表

2 样品采集与保存

为保证研究方法所得实验结果的可靠性与全面性，根据本辖区（朝阳区）近几年水质监测数据，特选取叶绿素a 浓度处于中营养、轻富营养、中富营养不同特征的红领巾湖、朝阳公园湖、镇海寺公园湖3个地表水点位进行方法研究与对比。依据文献[3]进行保存与运输。

3 实验方法分析步骤

3.1 样品过滤

在过滤装置上装好滤膜，根据水体营养化状态确定取样体积。虽然都属于中营养化水平，但红领巾湖程度偏轻，用量筒量取200 mL 的混匀样品，朝阳公园湖和镇海寺公园湖程度偏重，分别量取100 mL 的混匀样品进行过滤，最后用少量蒸馏水冲洗滤器壁。过滤时负压不超过50 kPa，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。

3.2 研磨

玻璃研磨器：手工研磨将样品滤膜放置于研磨装置中，加入3～4 ml 丙酮溶液，研磨至糊状。补加3～4 mL丙酮溶液，继续研磨，并重复1～2 次，保证充分研磨5 min 以上。将完全破碎后的细胞提取液转移至玻璃刻度离心管中，定容至10 mL。

组织研磨器：本文选用珠磨式研磨仪，通过剧烈晃动装有待测滤膜、玻璃珠（直径0.5 mm）和提取液的微离心管，使数百颗玻璃珠竖直运动的同时高速撞击滤膜，研磨5 min 后将完全破碎后的细胞提取液转移至玻璃刻度离心管中，定容至10 mL。

3.3 浸泡提取、离心、测定

依据文献[3]进行浸泡提取、离心、测定。

3.4 计算

叶绿素a（μg/L）=［11.85×（D664－D750）－1.54×（D647－D750）－0.08×（D630－D750）］×V1/V2·δ，式中V1为提取定容后的体积（mL），V2为样品体积（L），D 为吸光度值，δ 为比色皿光程（cm）。

4 测定叶绿素a 方法研究

4.1 滤膜的比对

4.1.1 空白试验测试

为确定改进方法的滤膜类型，研究不同类型滤膜对水样叶绿素a 测定结果的影响，文献[1]采用的是乙酸纤维滤膜，文献[3]采用的是玻璃纤维滤膜过滤水样。

首先比较不同滤膜的吸光度。将空白水样作为样品，每组实验设7个平行，抽滤体积为500 mL，与实际水样按相同步骤操作，以丙酮溶液为参比，于波长750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 处测量吸光度。

结果表明乙酸纤维滤膜和玻璃纤维滤膜在750 nm 处吸光度小于0.005，见表3，两种滤膜都符合开展监测叶绿素a 浓度的条件。

表3 空白试验测试结果

4.1.2 检出限、测定下限的测试

由于空白试验无法检测到目标测试物，按照HJ 168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》[7]的指导规范，选择方法检出限值3~5 倍的样品（红领巾湖）进行7 次平行测定，计算公式：MDL=t×S，其中S 为7 次重复样品的标准偏差，t 是当自由度为n-1，置信度为99%时，单边t 检验情况下的标准偏差，查表可得t=3.143，结果见表4。

表4 红领巾湖方法检出限、测定下限测试结果 单位:μg/L

玻璃纤维滤膜7 次平行测定计算得到检出限为1.49 μg/L，测定下限为5.96 μg/L，乙酸纤维滤膜7 次平行测定计算得到检出限为1.54 μg/L，测定下限为6.16 μg/L，两种滤膜均低于标准HJ 897—2017[3]中规定检出限2 μg/L、测定下限8 μg/L 的要求。但通过数据可以看出，玻璃纤维滤膜的测试结果更优于乙酸纤维滤膜。

4.1.3 滤膜精密度测试

再研究玻璃纤维滤膜与乙酸纤维滤膜对实际水样中叶绿素a 测定结果的影响，本文选取本辖区内处于中营养、轻富营养、中富营养不同特征的红领巾湖、朝阳公园湖、镇海寺公园湖作为样品，同时为减少实验人为误差，研磨方式统一选用本文3.2 中的珠磨式研磨仪。对比两种滤膜在相同实验条件下，不同滤膜对实验结果的影响程度，结果见表5。

表5 滤膜精密度测试结果 单位：μg/L

测定实际水样的过程中发现，玻璃纤维滤膜呈化学惰性，不含粘合剂，不发生溶解，玻璃纤维滤膜在研磨过程中较难研磨，需要的机械力比较大，但对于藻类细胞的破碎比较完全。乙酸纤维滤膜抽滤速度较慢，抽滤同一样品的时间约是玻璃纤维滤膜的2～3 倍；同时，乙酸纤维滤膜部分溶于丙酮，遇丙酮融化成糊状，不容易完全转移，而且不容易判断研磨是否充分。

4.1.4 方法比对t 检验

对于改进方法中玻璃纤维滤膜与原方法乙酸纤维滤膜进行统计学检验，对三种浓度的实际样品进行7次平行测定，同时对每个浓度样品使用改进方法与原方法均分别进行平行双样测定，平行双样测定的平均值分别记做改进方法的测定值（A）和原方法测定值（B）。通过t 检验对对比试验结果进行评价，测试结果见表6，t 检验计算公式为

表6 方法比对t 检验结果表 单位：μg/L

经过计算得出低、中、高三种不同浓度下t 值分别为1.641、1.889、1.110，给定α=0.05，查t 值表：t0.05（12）=2.179，三种浓度下的t 值均小于t0.05（12），所以两种方法测定结果无显著性差异，比对测试结果满意。

4.2 研磨方式

4.2.1 研磨方式精密度测试

本文通过人工研磨与珠磨式研磨仪对比，测试不同研磨方式对实验结果的影响程度，结果见表7。

表7 研磨方式精密度测试结果 单位：μg/L

通过实验及数据对比发现，珠磨式研磨仪操作简单，研磨过程中研磨管带有螺纹研磨盖，大幅度减少光照对叶绿素a 测定的影响，同时减少丙酮的挥发与飞溅；另一方面，研磨较为充分，样品滤膜经过浸泡离心后，比较容易沉入离心管底部，方便上清液的提取。

4.2.2 准确度测试

为进一步论证珠磨式研磨仪的准确度，特加入人员比对测试，参与比对测试人员均持有《水质 叶绿素a 测定 分光光度法》的测定证书，采集三种不同浓度水样，通过相同实验条件对同一水样进行测试，测试结果见表8。

表8 人员比对测试结果 单位：μg/L

比对结果表明三种浓度样品不同人员测定的相对偏差分别为2.5%、1.8%、1.1%，符合平行样的相对偏差值<20%的要求。

5 结论

5.1 滤膜比较优势

玻璃纤维滤膜较乙酸纤维滤膜的优势在于：

（1）玻璃纤维滤膜呈化学惰性，不含粘合剂，不发生溶解，对于藻类细胞的破碎比较完全，减少误差；

（2）玻璃纤维滤膜表面截留的藻类含量高、研磨率高，对叶绿素的提取效率较好；

（3）测定结果表明玻璃纤维滤膜所测得叶绿素a的浓度值更准确。

5.2 研磨方式比较的优势

组织研磨较人工研磨的优势在于：

（1）珠磨式研磨仪操作简单、节省时间，研磨过程中研磨管带有螺纹研磨盖，较大程度减少丙酮的挥发与飞溅及光照条件对叶绿素a 测定的影响；

（2）在测定叶绿素a 的研磨过程中需要加入90%丙酮作为提取试剂，运用珠磨式研磨仪减少对实验人员与丙酮试剂的接触，较大程度减少影响实验人员健康存在的隐患；

（3）珠磨式研磨仪研磨较为充分，减少实验人员判定误差，同时，样品滤膜经过浸泡离心后，比较容易沉入离心管底部，方便上清液的提取。

5.3 改进方法满足标准要求

由以上各项实验数据的比较结果，可以得出结论：选择玻璃纤维滤膜和组织研磨方式在空白实验、检出限、精密度和准确度方面都满足HJ 897—2017《水质 叶绿素a 的测定 分光光度法》的要求，可以选用改进方法。