养阴通脑颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用*

王如琪 张洋洋 杨洁红 何 昱 丁志山 万海同 虞 立

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

脑血管疾病是临床上常见的一类神经系统疾病，60%～80%为缺血性脑血管疾病［1］。脑缺血是由于血管堵塞造成的脑血流量减少，脑缺血时间越长，脑损伤越严重。一方面，缺血再灌注能够挽救缺血半暗带内濒死的细胞；另一方面，再灌注后由于各种原因会使神经细胞加重损伤以致死亡，引发脑缺血再灌注损伤。因此，在脑缺血的治疗中，防止再灌注损伤显得尤为重要。在神经系统疾病中，炎症反应起着关键性作用，尤以NLRP3炎性小体最为重要。脑缺血后会诱导NLRP3的表达和活化，激活白细胞介素-18（IL-18）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），三者相互影响、相互作用，进一步促进神经炎症以及细胞毒性。此外，脑缺血还会导致STAT3磷酸化，引发神经元凋亡，加重脑损伤等。养阴通脑颗粒是现代中药复方制剂，具有抗氧化、抗炎、抗血栓、增加脑血流量、改善微循环、抑制神经细胞凋亡等作用［2-3］。本实验采用改良线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察养阴通脑颗粒对脑缺血再灌注损伤的保护作用，并进一步研究其作用机制，以期为心脑血管等疾病方面的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠，体质量（280±20）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物质量许可证号：SCXK（浙）2018-0012。动物实验经浙江中医药大学动物学科评审委员会批准。

1.2 试药与仪器 养阴通脑颗粒（药物组成：生地黄、黄芪、葛根、川芎等，由浙江中医药大学心脑血管病研究所自主研发［4］，华东医药股份有限公司提供颗粒剂）。氯化三苯四氮唑（TTC，南京建成科技有限公司，批号：BCCB1241）；IL-18检测试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司，货号：MB-1735A）；TNF-α检测试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司，货号：MB-1721A）；DEPCH2O（上海捷瑞生物工程有限公司，批号：2006G15）；总RNA提取试剂盒（美国英杰生命技术有限公司，批号：223306）；反转录试剂盒（上海佰晔生物科技中心，货号：G490）；引物（上海生工生物科技有限公司）。酶标仪（美国 MD SpectraMax Plus384）；Sigma 2-16PK离心机（Sigma公司）；QuantStudio 3定量PCR仪（美国ABI）；微量核酸蛋白分析仪（美国热电）。

1.3 模型制备 采用Longa等［5］的改良线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。手术前12 h禁食不禁水，用10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。仰卧位固定大鼠，腹面向上，剃毛器剔除颈部毛发并用酒精棉球擦拭消毒，用剪刀在颈部正中位置切一小口，分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，然后用丝线结扎颈总动脉近心端和颈外动脉根部，用微型动脉夹夹住颈内动脉，在颈总动脉近分叉部剪一小口，将线栓的圆头端自切口推入，打开动脉夹，至线栓黑色标记到达三叉口处停下。此时，大鼠脑中动脉起始端的供血已被完全阻断，脑缺血模型制备成功，1 h后，轻轻拔出线栓实现再灌注。假手术组除不插入线栓外，其余同模型组。判断模型成功的标志为苏醒后大鼠右眼呈现Horner征，提尾时出现左前肢内收屈曲，行走时向左侧转圈或倾倒，且取材时未发现颅底出血。

1.4 分组与给药 大鼠随机分为假手术组、模型组、养阴通脑颗粒组。将养阴通脑颗粒用生理盐水溶解，配成混悬液，按1.73 g/（kg·d）灌胃给药，假手术组与模型组灌胃等量生理盐水。各组每日给药1次，连续3 d。

1.5 神经功能评分 建立模型后24、48、72 h采用Longa5级4分法［6］对大鼠神经功能进行评分。0分：无神经功能缺损症状。1分：轻度局灶性神经功能缺损，即提尾时对侧前肢内收屈曲，不能完全伸展对侧前肢。2分：中度局灶性神经功能缺损，即行走向对侧转圈。3分：重度局灶性神经功能缺损，即行走困难并向对侧倾倒。4分：意识水平下降，无法自发行走。

1.6 标本采集与检测 1）脑梗死体积比。给药结束后断头取脑，将脑组织放置在-20℃冰箱中冷冻约15 min，以2 mm厚度切取冠状组织6片，然后置于2%TTC溶液中，37℃下孵育30 min染色至显色完全，正常的脑组织被染为深红色，梗死的区域显示为灰白色。最后将脑切片按顺序排列整齐，用数码相机拍照，通过图像分析软件Image计算梗死体积比。2）RT-PCR法检测NLRP3、STAT3。取大鼠脑组织，分离缺血侧半脑，用总RNA提取试剂盒提取脑组织匀浆中的总RNA，逆转录按照试剂盒说明书操作。引物序列如下：NLRP3 正向：5′-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3′，反向：5′-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3′；STAT3正向：5′-AATATAGCCGATTCCTGCAAGAG-3′，反 向 ：5′-TGGCTTCTCAAGATACCTGCTC-3′；GAPDH 正向：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；反 向 ：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。分析各组mRNA含量采用 2-ΔΔCt法，参比基因为 GADPH。3）ELISA 法检测IL-18、TNF-α水平。采集血浆，4℃下4 000 r/min离心10 min，取上层，按照试剂盒说明书分别对IL-18、TNF-α进行测定。

1.7 统计学处理 应用SPSS25.0统计软件。实验数据以（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经行为学评分比较 见表1。与假手术组比较，模型组Longa评分明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，养阴通脑颗粒组能明显减轻大鼠的神经功能缺损症状（P＜0.01）。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（分，±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

72 h 0 2.33±0.52**0.67±0.52△△组别假手术组模型组养阴通脑颗粒组n 12 12 12 24 h 0 2.50±0.55**1.67±0.52△△48 h 0 2.67±0.52**1.17±0.75△△

2.2 各组大鼠脑梗死体积比较 经TTC染色后，正常脑组织呈深红色，梗死区域呈灰白色，各组TTC染色比较见图1。模型组脑梗死体积比为（0.36±0.05），与假手术组比较显著增加（P＜0.01）；养阴通脑颗粒组脑梗死体积比为（0.18±0.03），与模型组相比明显减少（P＜0.01）。

图1 各组大鼠脑梗死组织TTC染色

2.3 各组大鼠脑组织NLRP3、STAT3 mRNA表达水平比较 见表2。与假手术组比较，模型组NLRP3、STAT3 mRNA水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，养阴通脑颗粒组NLRP3、STAT3 mRNA水平显著降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠脑组织NLRP3、STAT3 mRNA表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠脑组织NLRP3、STAT3 mRNA表达水平比较（±s）

组别假手术组模型组养阴通脑颗粒组n 12 12 12 NLPR3 mRNA 0.63±0.55 5.67±1.38*1.70±0.68△STAT3 mRNA 1.00±0.12 3.67±1.38*1.87±0.40△

2.4 各组大鼠血浆IL-18、TNF-α水平比较 见表3。与假手术组比较，模型组IL-18、TNF-α水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，养阴通脑颗粒组IL-18、TNF-α水平显著降低（P＜0.01）。

表3 各组大鼠血浆IL-18、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组大鼠血浆IL-18、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

组别假手术组模型组养阴通脑颗粒组n 12 12 12 IL-18 145.73±4.54 167.32±6.98**155.40±1.46△△TNF-α 217.89±10.53 262.05±3.53**242.65±7.71△△

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤属于中医学“中风”范畴，具有高发病率、高致残率和高死亡率，严重威胁人类健康，血瘀气虚则是其发病的关键。研究表明，血瘀、气虚与炎症损伤密切相关。对于缺血性中风多采用活血益气法，而养阴通脑颗粒具有养阴益气、活血化瘀的功效。故本实验研究了养阴通脑颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用，并进一步探讨其作用机制。

神经炎症在中枢神经系统疾病中起着关键性作用，当脑部促炎和抗炎细胞因子处于平衡状态时，可极大地促进脑损伤后受损组织的修复，但是当炎症反应过度时，则会引起继发性损伤，导致神经元凋亡等［7］。脑缺血会激活固有免疫系统，小胶质细胞活化并释放大量炎症因子，引起脑组织继发性损伤，其中NLRP3炎性小体作为炎症反应的核心，在神经系统炎症中发挥了重要作用［8-9］。脑缺血会诱导NLRP3的表达增加和活化，使其活化的产物IL-18、IL-1β和Caspase-1水平升高，加重血脑屏障损伤、炎症反应和缺血损伤［10-12］。本研究表明，养阴通脑颗粒能降低NLRP3炎性小体的表达和活化水平，发挥抗脑缺血再灌注损伤作用。

大鼠脑缺血再灌注损伤后，IL-18和TNF-α被强烈激活，导致局灶的炎症反应，进而引起炎症反应的扩散［13］。TNF-α能干扰大脑的正常功能，激活小胶质细胞和星形胶质细胞，影响血脑屏障的通透性［14］。在中枢神经系统中，IL-18主要由小胶质细胞产生，能以自分泌和旁分泌的形式增强小胶质细胞中Caspase-1的表达，并诱导促炎性细胞因子TNF-α的分泌。此外，IL-18还会导致多形核白细胞（PMN）的呼吸爆发和脱粒，引起神经毒性酶的释放，经单核细胞分泌的干扰素-g（IFN-g）刺激，还会释放出活性氧（ROS），进一步促进神经炎症和细胞毒性。实验结果说明，养阴通脑颗粒组能够显著降低脑缺血再灌注损伤脑组织中IL-18和TNF-α的表达水平，有效抑制脑缺血后的神经炎症反应。

最近的研究表明，STAT3在脑卒中后的血管生成方面起着重要的作用。脑缺血损伤会导致STAT3磷酸化并转移到细胞核，磷酸化的STAT3增多则会引起神经元的凋亡增多［15］。此外，STAT3还参与了小胶质、巨噬细胞的形态分型，抑制STAT3可使小胶质细胞静止并促使M1型小胶质细胞向M2型转化，发挥更有效的抗炎作用［16］。本实验结果显示，养阴通脑颗粒能降低脑组织中STAT3的含量，减少炎症介质的产生，保护脑组织免受缺血/再灌注损伤。

综上，养阴通脑颗粒可减少神经功能损伤，减小脑梗死体积，降低NLRP3、STAT3、IL-18、TNF-α的表达水平。本实验为研究养阴通脑颗粒对脑缺血再灌注损伤的炎症保护作用提供了参考，并为其在心脑血管等疾病方面的应用提供实验依据。