便携式生物传感器在真菌毒素检测中的应用研究进展

王沂雯，刘晏霖，付瑞杰，刘浩然，周 静，赵其阳，王成秋，焦必宁,*，何 悦,*

（1.西南大学柑桔研究所，重庆 400712；2.农业农村部柑桔及苗木质量监督检验测试中心，重庆 400712）

真菌毒素是真菌产生的有毒次级代谢产物，能干扰细胞抗氧化系统的功能，降低细胞对毒素的抵抗能力，对人类和动物的健康危害极大。目前，研究者们现已分离出400多种真菌毒素，并对它们的结构和性能进行了相关研究。由于其特殊的物理、化学性质，导致毒性难以被外界条件所破坏。在众多的真菌毒素中，对生命体具有较大毒性的主要有黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）、赭曲霉毒素（ochratoxins，OT）、展青霉毒素（patulin，PAT）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等。值得注意的是，大多数真菌可以同时产生多种真菌毒素。因此，被真菌感染的农作物、饲料及食品往往同时受到多种真菌毒素的污染。

近年来，由真菌毒素造成的食品安全事件频频发生，众多科学家们为实现对真菌毒素的有效监测进行了孜孜不倦地探索。目前已经开发了多种用于真菌毒素定量检测的方法，如薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色谱法（highperformance liquid chromatography，HPLC）、液相色谱串联质谱法（liquid chromatogram tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等。以上方法可以实现真菌毒素准确、灵敏和多组分同时检测，在实验室中得到了广泛的应用。但这些用于真菌毒素定量检测的方法通常需要大型且精密的仪器、熟练的操作人员以及复杂的样品前处理，限制了它们在真菌毒素现场检测中的应用。因此，开发操作简单、设备轻便、检测速度快、灵敏度高、特异性强、重现性好、准确度高的生物传感器以用于真菌毒素的即时检测具有重要的科学意义。

便携式生物传感器由于其操作方便、体积小巧、检测速度快、精确度高且检测专一性强等优点，可满足目标分析物现场即时检测的需求，受到了研究者们的高度重视。其可以在专业实验室外对目标物进行检测，缩短了数据输出的时间，方便且快捷。近些年来，研究人员将一些成本低、简单易得的材料及商品化小型仪器用于便携式生物传感器的构建，致力于实现真菌毒素的即时检测。本文综述试纸条、个人血糖仪（personal glucose meters，PGM）、手持式pH计、气压计、智能手机、微流控芯片以及基于可视化、电化学、等离子体等输出信号的便携式生物传感器在真菌毒素现场检测应用中的研究进展，同时对真菌毒素的现场检测这一领域的发展前景进行阐述。

1 便携式生物传感器中真菌毒素的识别元件

由于真菌毒素对食品的污染具有较高的风险性，并且还对人、畜、环境具有严重的危害性，因此，开发性能优异的检测技术对农产品及食品中的真菌毒素进行实时监测成为迫切需要，以保障食品安全和人类健康。便携式生物传感器是对目标分析物进行微量检测的小型器件，其工作原理为当识别元件和目标分析物结合之后，信号探针会产生与目标分析物浓度相关的信号，最后利用仪器仪表可读出检测信号。它具有便于携带、用户友好的优点，能够作为目标分析物即时检测的有利工具。但其检测灵敏度、响应速度和特异性易受识别元件的影响，因而在便携式生物传感器中其识别元件起着至关重要的作用。目前用于真菌毒素检测的最常见的识别元件为抗体、核酸适配体和分子印记聚合物（molecular imprinted polymers，MIPs）。以下将对真菌毒素的抗体、核酸适配体和MIPs的制备和性能进行简要介绍。

1.1 抗体

1.1.1 单克隆抗体

单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）是一种由效应B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，与抗原特异性结合的大型Y形蛋白质。mAb是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，因其高度特异性而被广泛应用于疾病诊断及治疗。随着研究人员的深入研究，抗体已被广泛地应用于构建酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法和免疫层析法中，实现了目标分析物的高灵敏、高特异性检测。为了能够将其更广泛地应用于科学研究中，研究者们还通过不同的化学试剂将酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、-半乳糖苷酶）、荧光染料（异硫氰酸荧光素、藻红蛋白等）、生物素等修饰到抗体上。楚金申利用生物素--羟基琥珀酰亚胺酯修饰的二抗建立了ELISA法检测玉米中的ZEN，检出限为0.42 ng/mL，该方法的检测时间为50 min。卢江等利用辣根过氧化物酶修饰的二抗建立了一种间接竞争化学发光酶免疫法实现了对玉米样品中ZEN的检测，检出限为0.09 ng/mL。通过制备修饰型抗体可进一步建立更多的检测方法用于食品中真菌毒素检测。

目前，也有越来越多的研究人员致力于真菌毒素的抗体筛选，部分已筛选出的真菌毒素单克隆抗体如表1所示。多数真菌毒素mAb已逐步实现商品化，如AF、OT、PAT、ZEN。对于单克隆抗体的制备多采用杂交瘤技术，主要包括免疫动物、细胞融合和选择性培养等过程。由于真菌毒素分子质量较小，属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原，因此，为了得到真菌毒素的特异性抗体，必须选择蛋白质大分子作为载体对毒素的结构进行修饰。常用的载体有牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、鸡卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）等。人工抗原制备好后再对鼠、兔等进行免疫以获得高质量的抗体，经鉴定获知抗体的类型及效价。例如，肖智等研制了AFBmAb。具体方法为：先将AFB转化为其半缩醛形式AFB，接着AFB和BSA氨基发生醛胺缩合反应，随后在硼氢化钠还原作用下得到免疫原AFB-BSA复合物。AFB-BSA免疫BALB/C小鼠后，3只小鼠第4次免疫后抗血清效价均高于1∶250 000。李华采用保护-去保护策略使DON的3位C上的羟基与琥珀酸酐反应，使DON衍生后获得一个羧基，得到衍生物3-半琥珀酰-DON（3-hemisuccinyl-DON，3-HS-DON）。再采用碳化二亚胺法将3-HS-DON与载体蛋白BSA进行偶联，利用快速蛋白液相层析系统对偶联产物进行分析，以确保制备得到3-HS-DON-BSA。用所制备的3-HS-DON-BSA作为免疫原，分别采用腹膜腔注射法和颈、背部多点注射法免疫BALB/C小鼠和豚鼠。经过间接ELISA法检测，豚鼠血清的效价为1∶6 400，小鼠血清的效价为1∶12 800。值得注意的是，虽然抗体的制备来源广泛，不仅可以借助老鼠还可以借助兔等其他动物来进行制备，但是抗体制备过程繁琐、生产成本高、稳定性差、批次间差异大，因此近年来，广大研究人员们致力于新型小分子抗体的研究。

表1 真菌毒素抗体Table 1 Antibodies against mycotoxins

1.1.2 纳米抗体

研究者们发现骆驼科动物（骆驼、羊驼）体内存在一种抗体亚类，由重链的一个可变区域组成，完全没有轻链，将其称为重链抗体（heavy chain antibody，HCAB）。对重链抗体可变区（variable heavy chain domain，VHHs）进行重组表达，便可得到仅包含VHHs的单个结构域抗体（single domain antibody，sdAb），又称VHH抗体，由于其大小只有普通抗体的1/10左右，故又被称为纳米抗体（nanobody，Nb）。Nb制备过程主要包括羊驼免疫、噬菌体文库构建和抗体筛选3个阶段。由于Nb具有分子质量小、组织穿透性强、抗原亲和力高、能识别隐藏表位、免疫原性低、结构稳定、水溶性好、生产成本低等优点，越来越多有毒有害物质的Nb被分离出来，并用于食品分析中免疫分析的检测。He Ting等用AFB-BSA免疫羊驼后，构建了Nb的噬菌体显示库。选择两个AFB的特异性Nb进行实验，开发了一种Nb 26的竞争性ELISA法，其半抑制剂量（half inhibition concentration，IC）为0.754 ng /mL，线性范围为0.117～5.676 ng/mL。结果显示，所分离的Nb是测定AFB的理想选择。Liu Xing等在大肠杆菌细胞中表达OTA的Nb（Nb15、Nb28、Nb32、Nb36），并与OTA特异性mAb 6H8的热稳定性进行比较。在95 ℃处理5 min或90 ℃处理75 min后，所有Nb仍然可以保持其抗原结合活性。然后选择在ELISA中敏感度最高的Nb28进一步研究，实验得出IC为0.64 ng/mL，线性范围为0.27～1.47 ng/mL。

1.2 核酸适配体

核酸适配体简称适配体，又被称为“化学抗体”，是通过指数富集配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术在体外核酸分子文库中筛选获得的碱基长度通常在20～60之间的单链DNA或RNA序列。适配体作为一种新型分子识别元件，利用自身折叠成特定的空间结构与靶物质高特异性结合。其靶物质可以是小分子、蛋白质、金属离子，甚至是特定的细胞。与蛋白质抗体相比，适配体具有分子质量小、靶分子广泛、稳定性好、易功能性修饰、易合成、成本低等优点。正是由于上述独特的优势，适配体作为一种理想的分子识别元件，已被广泛应用于多个领域。研究者们可根据检测需要对目标物的适配体进行相应的修饰，例如，陶醉将辣根过氧化物酶修饰到伏马毒素B的适配体上，构建了基于适配体-辣根过氧化物酶的检测方法，通过肉眼观察和测定450 nm处的吸光度实现了对目标物定性和定量检测，在优化条件下检出限为0.30 ng/mL；喻婕将适配体修饰到金纳米颗粒（Au nanoparticles，AuNPs）表面，以实现信号放大，通过AuNPs的特征吸收峰与待测AFB浓度的相关性来检测目标物质量浓度，AFB检出限为4.1 pg/mL。对于适配体的修饰工作研究者们还在进一步根据实际检测需要不断完善。

为了丰富真菌毒素高效、高特异性的检测手段，广大研究人员也逐渐投入到真菌毒素适配体的筛选中。目前适配体的筛选仍然以SELEX技术为基础，但是传统的SELEX技术耗时长、过程繁琐，已不能满足实际需要，因此研究者们对该技术进行了改进，如目前已报道的氧化石墨烯-SELEX、人类基因组-SELEX、石英晶体微天平-SELEX和计算机辅助-SELEX等。与传统的SELEX技术相比，氧化石墨烯-SELEX技术不需要对靶标进行固定，简化固定程序，并保持了靶标的天然构象，筛选出的适配体亲和力强；人类基因组-SELEX技术使用天然RNA/DNA作为核酸库，减少了序列随机性，与目标物实际核酸序列更贴近；石英晶体微天平-SELEX可实时观测筛选过程，不需要分离结合和游离的核酸分子；计算机辅助-SELEX可在提升筛选效率的同时节省实验成本。但这些改进的SELEX技术仍存在一些不足，如：石英晶体微天平-SELEX技术在经过多次轮筛之后会使筛选效率下降；计算机辅助-SELEX技术没有统一软件实现小分子适配体筛选。因此，在适配体高效筛选上仍有很大的发展空间。对于真菌毒素的筛选研究者们还在不断的摸索。Ma Xiaoyuan等利用SELEX技术筛选出了AFB的适配体。经过10 轮筛选和扩增，富集后得到30个适配体序列。结合同源性和结构分析以及亲和力和特异性实验，最终获得了对AFB具有最佳亲和力和特异性的适配体序列。该适配体序列和AFB的解离常数（）为11.39 nmol/L。Malhotra等采用两个SELEX过程（称为SELEX1和SELEX2）来筛选AFM的适配体。在SELEX1中，使用外切核酸酶生产ssDNA，而在SELEX2中，使用快速冷却将dsDNA转化为ssDNA，共获得41个不同的适配体序列（36个AFM适配体序列，5个AFB适配体序列）。值的测定结果表明，AFM适配体的值在35～1 515 nmol/L范围内，AFB适配体的值在96～221 nmol/L范围内。此外，同一种毒素经不同课题组筛选，获得了序列不相同的多条适配体，部分适配体序列详见表2。

表2 真菌毒素适配体Table 2 Aptamer for mycotoxins

1.3 分子印记聚合物

MIPs表示能够与目标分析物相互作用从而选择性地结合识别元件，它可以识别蛋白质、红细胞、病毒及毒素等物质。与天然抗体相比，MIPs具有更好的结合性和选择性，此外，MIPs耐高温、高压和酸碱，可回收，易于储存，已被广泛应用于环境污染物分析、食品质量与安全、生物样品分离与富集等多个领域。在MIPs合成过程中，所合成聚合物的官能团对特定的模板分子具有选择性，完成聚合之后，移除模板分子从而在聚合物基体中产生识别位点。MIPs有许多合成方法，其方法的选择取决于MIPs的大小、应用领域等，其中最为常用的是非共价键相互作用。MIPs合成技术的完善与进步也推动了基于MIPs生物传感器的发展。Wang Qingling等建立了一种基于三联吡啶钌[Ru(bpy)]掺杂硅纳米颗粒（RuSi NPs）结合MIPs的电化学发光传感器，运用电化学发光技术以及印记技术检测玉米样品中的OTA，其检出限为0.027 pg/mL。Huang Zhipeng等以MIL-101为载体，以香豆素-3-羧酸为ZEN的模板，甲基丙烯酸为功能性单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯羟基丙烯酸甲基乙酯为交联剂，制备了MIPs用于谷物样品中ZEN的检测。Wyszomirski等以5,7-二甲氧基香豆素作为AFB的替代品用于MIPs合成。结果表明，甲基丙烯酸和烯丙胺都可作为功能单体，对AFB和5,7-二甲氧基香豆素均有类似的结合作用。MIPs是一项有前景的识别原件，在检测方面有很大的创新空间，但是因其缺少天然生物识别分子的柔性结构，在一定程度上影响了其亲和力与灵敏度，从而限制了其在实际生产中的应用。

2 便携式生物传感器在真菌毒素检测中的应用

2.1 基于侧流层析试纸条的便携式生物传感器

侧流层析试纸条（lateral flow strips，LFSs）是以条状纤维层析材料为固相，借助毛细作用使样品在层析材料上进行移动，并通过直接显色的标记物或酶促显色反应在短时间内获得直观检测结果的检测方法。与传统的检测方法相比，基于LFSs的检测方法具有特异性强、成本低、易操作、不需要大型仪器设备等优点，同时也是目前报道最多、应用最广的现场检测方法。此外，基于LFSs的检测方法可通过肉眼观察判定检测结果。因此，该类方法表现出的结果可视性和即时性为现场检测提供了一个很好的平台，已被研究者们广泛应用于微生物、真菌毒素、农药等的检测中。基于LFSs的检测方法有三类信号输出方式：一类为通过颜色变化判定目标分析物的比色检测方法；一类为通过荧光信号的变化判定目标分析物的荧光检测方法；一类为通过磁信号变化判定目标分析物的检测方法。下面分别对这三类信号输出方法对真菌毒素的检测进行一一阐述。

2.1.1 比色侧流层析试纸条

基于颜色变化的比色LFSs是LFSs的重要组成部分，因其制作成本低、操作简便、检测速度快且不需要昂贵的检测仪器而引起了研究者的广泛兴趣。比色LFSs可以根据其检测线颜色的变化实现目标分析物的可视化检测，因此在真菌毒素分析领域中得到了广泛的应用。

2.1.1.1 纳米金标记侧流层析试纸条

AuNPs具有合成技术简单、在多孔膜中的迁移率好、颜色鲜艳等优点，在LFSs领域备受青睐。AuNPs在LFSs上大量聚集时会产生红色或粉色的斑点，可实现目标物的定性或半定量的检测，被广泛地应用于真菌毒素的检测中。Hu Shurong等首次采用AuNPs标记的免疫LFSs用于根茎药材中AFB的快速检测。该方法采用AFB-BSA标记试纸条的检测线，二抗标记控制线。当阴性样品溶液滴在样品垫上时，通过毛细管力将AuNPs标记的抗体复合物重新溶解在样品溶液中，随后该混合物迁移到检测线和控制线。检测线的AFB-BSA和控制线的二抗均能捕获AuNPs标记的抗体复合物，使AuNPs在试纸条的检测线和控制线聚集，检测线和控制线均显色；而当阳性样品溶液滴在样品垫上时，样品溶液中AFB和检测线上的AFB-BSA相竞争，导致试纸条上检测线颜色变浅，只在控制线上表现出明亮的颜色。试纸条上控制线的设置是为了确保试纸条的有效性。在优化实验条件下，所构建的免疫LFSs对AFB的检出限低至0.1 ng/mL，检测时间仅需15 min。尽管中药基质具有复杂性，但该方法仍以简单的程序实现了对药材根茎中AFB的高选择性、高灵敏性的快速检测。基于相似的原理，Anfossi等建立了基于AuNPs标记的LFSs实现了葡萄酒和葡萄汁中OTA的快速检测（5 min），检测灵敏度为1 ng/mL。由于食品中真菌毒素的含量极低，为了提高AuNPs标记的LFSs灵敏度，其通过引入了“金标银染”信号放大技术对检测信号进行放大。“金标银染”放大技术的基本原理为利用还原剂将银离子还原并沉积在AuNPs的表面，形成一层银外壳。由于银具有较高的摩尔吸光系数，因此“金标银染”能显著放大检测信号，将该方法的灵敏度提高了10余倍。

基于先前的阐述，适配体相较于抗体具有价格低廉、稳定性好、易于标记等优势，因此科研工作者研究了以适配体为识别元件的LFSs对真菌毒素的检测性能。例如，Zhou Weilu等开发了一种基于适配体的LFSs，实现了对黄芪中OTA的现场检测。在最佳条件下，所开发的LFSs对OTA的检出限是1 ng/mL，且与几种同源毒素没有显著的交叉反应，整个检测过程可在15 min内完成。以上结果表明在LFSs开发方面，适配体具有与抗体相比拟的检测灵敏度。此外，Wu Shijia等也采用适配体为识别元件，研制了检测ZEN的LFSs，对ZEN的检测范围为5～200 ng/mL，检出限为20 ng/mL。

值得注意的是，由于农产品及食品往往同时受到多种真菌毒素的污染，当用传统检测装置对单一目标物逐一检测时，在增加时间成本同时也会增加经济成本。因此开发简单、快捷且可以同时检测多种真菌毒素的装置显得尤为重要。Zhang Xian等则研制出可同时定量检测玉米、小麦和饲料样品中OTA和ZEN的LFSs。该免疫LFSs对OTA的检出限为0.32 ng/mL，检测范围为0.53～12.16 ng/mL；对ZEN的检出限为0.58 ng/mL，检测范围为1.06～39.72 ng/mL。随后，Hou Silu等报道了一种基于25 nm AuNPs的多重免疫层析法，可同时定性检测小麦和玉米样品中的伏马毒素B、DON和ZEN。该免疫LFSs具有较高的灵敏度，对伏马毒素B、DON和ZEN的检出限分别为60.0、12.5、6.0 ng/mL，且检测结果与LC-MS检测结果一致。

2.1.1.2 多色纳米粒子标记侧流层析试纸条

虽然上述基于AuNPs的免疫层析法可实现对真菌毒素的高灵敏和快速检测，但由于同时检测多种真菌毒素时，因其不同条带表现相同的颜色，极易因为视觉干扰导致最终结果读出错误。因此，开发避免视觉干扰的免疫LFSs十分重要。例如，一些研究者通过增加测试线之间的距离来避免视觉的干扰，但是提高了膜的成本和延长了检测时间。为了更好地解决这一问题，di Nardo等研制了一种基于蓝色沙漠玫瑰状AuNPs和红色球形AuNPs的多色免疫LFSs实现了对小麦粉中AFB、伏马毒素的同时检测。AFB和伏马毒素的检出限分别是2 μg/kg和1 000 μg/kg，检测时间为10 min。此外，Xu Lin等开发了一种多色免疫LFSs实现了对玉米和谷类动物饲料中AFB、ZEN和T-2毒素的同时测定。他们将以上3种毒素的mAb分别标记绿色、蓝色和红色的羧基改性纳米颗粒，得到信号探针。AFB、ZEN和T-2检出限分别是0.5、2.0、30.0 ng/mL；检测速度快，仅需20 min便可完成以上3种真菌毒素的分析，且该多色纳米粒子标记的LFSs具有较强特异性和较高稳定性，在真菌毒素的现场检测中具有巨大的应用前景。

2.1.2 荧光侧流层析试纸条

荧光LFSs离不开荧光标记物质的合理选择。具有荧光特性的物质是指一类在受到外界特定波长的光激发时，吸收能量后电子从基态跃迁到激发态，电子在返回基态时释放出光子，产生荧光的物质。荧光物质主要包括有机荧光染料和无机纳米粒子。在众多有机荧光染料中，属于水溶性3-吲哚菁型生物荧光标示染料的Cy5，易于与抗体进行偶联，并且具有较好的荧光强度，因而常用于荧光LFSs的开发中。例如，Zhu Chao等将Cy5标记在AFB适配体上，检测线和控制线分别标记AFB和适配体的互补链，通过竞争结合的原理，实现了AFB的高灵敏检测，检出限低至0.1 ng/mL。该Cy5标记的荧光LFSs在11种食物和饲料样本的AFB分析中表现出良好的灵敏度和特异性。然而，由于Cy5为有机荧光染料，其具有荧光稳定较差、易于被光漂白的缺点，不适宜于长时间观察检测结果。量子点（quantum dots，QDs）作为一种新型的荧光纳米材料，与有机荧光染料相比，QDs具有较宽的激发光谱、较窄的发射光谱、一元激发多元发射、较高的荧光稳定性等独特优势，在荧光LFSs的构建中具有较大的应用潜力。例如，Wang Libing等首次提出了一种基于适配体修饰QDs的荧光LFSs。该荧光LFSs通过竞争结合的原理实现了对OTA的检测。当样品溶液中不存在OTA时，QDs标记的适配体与测试线上标记的DNA探针1杂交，测试线上显示较强的荧光信号；当样品溶液中存在OTA时，OTA与QDs标记的适配体结合，测试线上的荧光信号减弱，基于测试线上荧光信号的强弱实现了样品中OTA质量浓度的测定。实验得到OTA检出限为1.9 ng/mL，检测时间仅需10 min。上转换纳米粒子（upconversion nanoparticle，UCNP）作为一类新型的荧光纳米材料，与传统的有机荧光染料和QDs不同之处在于其具有反斯托克斯（Stocks）的发光特性。具体而言，UCNP具有长波激发、短波发射的特点，因而在生物传感领域可克服样品或基质自发荧光的缺点，使得背景荧光信号显著降低，进而提高了检测的灵敏度，是当前荧光生物传感器领域的热点研究材料。例如，Wu Shijia等将UCNP与适配体相结合建立了用于OTA检测的荧光LFSs。在该方法中，研究者先合成了羧基修饰的UCNP，再通过化学键合与氨基修饰的OTA适配体连接，形成信号探针。当样品中没有OTA时，信号探针将与标记在测试线上的OTA适配体互补DNA杂交，过量的探针与标记在控制线上的聚腺苷酸进行杂交。在980 nm激光激发下，控制线和测试线上均观察到绿色荧光信号；当样品中含有OTA时，OTA首先会与信号探针上适配体结合，结合产物沿硝化纤维素膜移动到达测试线时，信号探针和标记在测试线上的OTA适配体互补DNA的结合被削弱，但是该结合产物仍会与控制线上的聚腺苷酸碱基进行杂交反应。因此，在980 nm激光激发下，测试线上观察到绿色荧光信号减弱，控制线上绿色荧光信号变化不大。最后用分析软件测量两条线的荧光强度，进行定量分析。在最优实验条件下，该LFSs可在12 min内实现OTA的高灵敏检测，线性范围为5～100 ng/mL，检出限为1.86 ng/mL。

2.1.3 磁信号侧流层析试纸条

磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）主要包括四氧化三铁纳米粒子、三氧化二铁纳米粒子和镍纳米复合材料等。MNPs具有合成简便、生物安全性高、独特的磁性能使其在生物传感领域具有广泛的应用。MNPs在靶分子的检测过程中可去除各种非目标物质，实现靶分子的分离和富集，减少基质干扰，放大检测信号。此外，基于MNPs磁信号变化的检测技术，与光学检测技术相比，具有独特的优势。例如，生物样品几乎不表现出磁性能，因此基于磁信号的检测背景信号干扰小，使其在检测食品基质的真菌毒素时无需进行复杂的前处理步骤便可获得较高的检测灵敏度。此外，MNPs的磁信号稳定性好，不会随着时间的延长而发生显著的变化，方便对检测结果随时复查。Liu Daofeng等研发了一种改良的LFSs（两步法）用于原乳中的AFM的检测。与传统的LFSs相比，该LFSs使用了两种免疫磁性纳米粒子（immunoma-gnetic nanoparticles，IMNPs），分别偶联了高抗体浓度的IMNPs用以捕获试验样品中的AFM、低抗体浓度的IMNPs用以AFM检测信号的获取。该LFSs对AFM的检出限为0.02 mg/L，与传统的LFSs相比较，灵敏度提高了25 倍。Guo Liang等将十八烷胺涂层的硒化镉/硫化锌量子点和油酸改性氧化铁纳米颗粒封装成两个具有不同疏水性能的复合材料，合成了具有独特核/壳结构的双功能的MNPs。在最佳检测条件下，该方法线性范围为5～150 pg/mL。在酱汁提取物和黑酱油中所得到的检出限分别为3 pg/mL和49 pg/mL。

2.2 基于个人血糖仪的便携式生物传感器

PGM是一种测量血糖水平的电子仪器，因其便于携带、检测快速、操作简便、检测结果直观且准确而被广泛应用于家庭健康实时监测中。Yu Xiang等创新性地以蔗糖酶为纽带，将PGM用于非葡萄糖分子的检测中，研究结果发表在杂志上。受到该研究的启发，以PGM为检测器件的真菌毒素便携式传感器的研究陆续展开。为实现真菌毒素与葡萄糖分子的关联，从而最终实现PGM对真菌毒素的检测，目前的信号传导方式主要有两种：一种是基于酶介导葡萄糖生成的信号传导方式，另一种是基于靶标诱导葡萄糖释放的信号传导方式。

2.2.1 基于酶介导葡萄糖生成的信号传导方式

Yu Xiang等利用PGM构建了用于OTA定量检测的便携式生物传感器。在该项研究中他们使用竞争法定量检测OTA。具体方法为制备OTA的mAb修饰的MNPs（MNPs-mAb）、DNA修饰的OTA（OTA-DNA）以及转化酶修饰的DNA互补链（转化酶-cDNA）用于OTA的检测。当样品液中不含OTA时，OTA-DNA与MNPs-mAb结合，加入转化酶-cDNA后，DNA与cDNA杂交，使得转化酶被MNPs捕获，加入蔗糖后，溶液中产生大量的葡萄糖，PGM检测出的信号值大；当样品液中含有OTA时，OTA相较于OTA-DNA与MNPs-mAb的结合力更强，此时加入转化酶-cDNA，转化酶无法被MNPs捕获，最终使得PGM检测出的信号值小。在该工作中，以转化酶为纽带，通过样品中OTA质量浓度与PGM测定的葡萄糖浓度之间的关系实现了OTA的定量检测，最终得到OTA检出限为6.8 ng/mL。上述方法需将DNA修饰在OTA上，以便与食品中的OTA竞争结合mAb，这无疑增加了检测成本以及操作难度。OTA适配体本质上是一段DNA序列，因此以适配体为识别元件时则无需制备OTA-DNA，更易于构建基于PGM的便携式传感器实现OTA的检测。例如，Long Feng等使用适配体为识别元件，构建了一种基于PGM的便携式传感器用于OTA检测。具体方法为：首先，通过简单的亲和素-生物素反应制得了MNPs-适配体；其次，将转化酶修饰连接在与适配体部分互补的DNA链上，得到转化酶-cDNA。当OTA不存在时，MNPs-适配体与转化酶-cDNA结合，磁分离后上清液中无转化酶-cDNA，加入蔗糖后，蔗糖无法水解产生葡萄糖，用PGM检测时所得信号值低；当OTA存在时，OTA与其适配体特异性结合，导致转化酶-cDNA从双链DNA结构中解离，磁分离后，上清液中存在大量的转化酶-cDNA，加入蔗糖后，蔗糖水解产生大量葡萄糖，用PGM进行检测时所得信号值高。利用该便携式传感器对缓冲液和红酒中的OTA进行检测，检出限分别为3.31 μg/L和3.66 μg/L。

由于食品中真菌毒素的含量极低，研究者们将基于分子机器的信号放大技术用于构建超敏便携式传感器，以实现食品基质中痕量真菌毒素的检测。DNA步行者传感器包含轨道DNA链和步行DNA链，通常情况下研究者们将轨道DNA链固定于电极或纳米材料上，步行DNA链的运动需要在在酶催化和链杂交反应驱动下才能进行。步行DNA链一旦被激活，DNA步行者分子机器就可以重复机械周期，从而实现检测信号的放大。DNA步行者具有可预测、快速的可编程特性，已被应用于不同的目标生物传感器的开发。Yang Xinsheng等构建了基于脱氧核酶驱动的DNA步行者分子机器，用于AFB的高灵敏检测。该方法的具体原理是在轨道DNA链上设计脱氧核酶的底物序列，并在其一端修饰蔗糖酶，一端修饰巯基，通过金硫键的相互作用将轨道DNA链固定在电极表面，此外步行DNA链上设计了脱氧核酶的酶序列。无AFB存在时，AFB的适配体与轨道DNA链上的底物链互补配对，使得步行DNA链上的酶链无法与轨道DNA链上的底物链结合，致使DNA步行者分子机器无法启动；AFB存在时，AFB与其适配体特异性结合，脱离了金电极表面，此时加入步行DNA链，步行DNA链上的酶链与轨道DNA链上的底物链结合，在铅离子辅助下，将轨道DNA链上的底物链切成两段，从金电极表面释放出轨道链上的蔗糖酶和步行DNA链。随着步行DNA链在轨道链上的持续行走，大量的蔗糖酶被释放。通过收集释放的蔗糖酶，溶液中的蔗糖被蔗糖酶转化成葡萄糖，最后通过PGM进行检测信号的读取。在优化实验条件下，该方法对面包中AFB的检出限低至10 pmol/L。

2.2.2 基于靶标诱导葡萄糖释放的信号传导方式

除了上文中所介绍的基于酶介导葡萄糖生成的信号传导方式以外，还有基于靶标诱导葡萄糖释放的信号传导方式。如Tang Dianping等制备了聚乙烯亚胺包覆的介孔二氧化硅纳米容器（polyethylenimine-coated mesoporous silica nanocontainers，PEI-MSN）和AFB的mAb标记的AuNPs（mAb-AuNPs），用于构建均相免疫检测新方法，实现了PGM对AFB快速、高灵敏在线检测。该方法的具体原理是PEI-MSN可将大量的葡萄糖分子装载进入其孔道中，由于mAb-AuNPs与PEI-MSN带有相反的电荷，它们之间的静电作用可使mAb-AuNPs作为“门”以避免葡萄糖分子从PEI-MSN中逃逸出来；在AFB存在下，由于mAb与AFB的亲和力远远大于其与PEI-MSN的亲和力，从而导致mAb-AuNPs从PEI-MSN表面脱落，最终导致葡萄糖从孔道里释放出来，利用PGM对释放出来的葡萄糖进行信号读取，可实现AFB的高灵敏检测，检出限为5 ng/kg。

2.3 基于温度计的便携式生物传感器

受到前文描述的将PGM应用于非葡萄糖分子现场检测的启发，科研工作者将越来越多的其他类型的小型化商用仪器作为信号读取设备，只需建立适当的信号传导方式，便可实现靶分子的现场检测。在众多小型化商用仪器中，温度计在我们的日常生活中使用最为广泛，是人们普遍会使用的小型仪器。并且，相较于血糖仪，温度计的价格也更低廉。因此，温度计可以用于构建便携式生物传感器，用于农药残留、真菌毒素、生物小分子等的检测中。

由于真菌毒素分子质量较小，采用传统的免疫检测法对真菌毒素进行检测时往往采用竞争免疫法。在竞争免疫法中，通常需要制备包被抗原或者抗原修饰的信号探针，以便和待测样品中的游离抗原竞争结合其mAb，最终实现靶分子的检测。需要注意的是，制备包被抗原或者抗原修饰的信号探针时，需要消耗大量的抗原，且在分离纯化的过程中使得抗原进入到环境中。由于真菌毒素作为抗原，其具有较大的毒性，因此采用该方法会对环境造成污染，也会对研究人员造成危害。为了克服这一问题，Chen Yanjie等创新性地通过噬菌体展示技术获得ZEN的模拟表位肽，并在该模拟表位肽上修饰具有良好光热性能的螺旋碳纳米管作为信号探针（peptides@HN-HCNTs）。ZEN与peptides@HNHCNTs竞争结合固相载体上的mAb，导致近红外激光照射下的温度升高量与ZEN的浓度成反比。该方法可成功应用于谷物中ZEN的便携式检测，线性检测范围为10～10ng/mL，检出限为1.06h10ng/mL。

2.4 基于pH计的便携式生物传感器

pH计是用来检测溶液酸碱度的电子器件，可以准确地测定溶液的pH值，作为易携带、操作简便、成本低和实验结果可量化的仪器，在构建生物传感器中得到了广泛的应用。目前，研究者们已经构建了以pH计为读出装置的生物传感器来检测细菌、DNA、真菌毒素等不同类型的靶标物。例如，Wang Lixu等将AFB标记在脲酶上（AFB-脲酶），采用竞争免疫法实现了pH计对AFB的高灵敏度、高选择性检测。具体方法为：首先将AFB的mAb修饰在MNPs上，获得用于AFB检测的IMNPs。无AFB存在时，IMNPs与AFB-脲酶结合，加入尿素，脲酶催化尿素水解，导致溶液pH值升高；当AFB存在时，IMNPs与AFB的结合能力强于与AFB-脲酶的结合能力，此时，IMNPs无法捕获脲酶，加入尿素后，尿素无法被水解，导致溶液pH值不发生变化。AFB在0.62～23.42 ng/L范围内，pH值与AFB质量浓度的对数呈线性关系。该便携式生物传感器可以用于食品基质中AFB高灵敏度、高选择性检测，具有很好的应用前景。需要注意的是使用该方法对AFB进行检测时，需进行多次分离、洗涤步骤，导致操作过程比较繁复。该方法属于非均相检测，而均相检测不需要进行分离和洗涤的步骤，因此操作简便更适宜于现场分析。

DNA水凝胶是一种三维网络结构的聚合物，由两条聚丙烯酰胺-DNA链和一条核酸适配体组成，其腔体可装载酶分子以及纳米粒子。当靶标物存在时，靶标物与其适配体特异性结合导致适配体发生构象变化，诱导DNA水凝胶瓦解，从而释放出包被的酶分子或纳米粒子，最终实现靶标物的均相检测。例如，Zhao Mengmeng等制备可用于AFB检测的DNA水凝胶，并将脲酶包裹在DNA水凝胶中。加入包含AFB的样品溶液后，AFB与其适配体结合，导致DNA水凝胶瓦解，致使脲酶被释放到溶液中，释放的脲酶催化尿素水解，导致溶液pH值升高，通过pH计对溶液pH值的测定，可实现AFB的便携式检测，该方法对AFB的检出限为0.1 µmol/L。

2.5 基于手持气压计的便携式生物传感器

压力的测量已经被广泛应用于多种检测领域当中。在封闭的器皿中，气体的生成可使压力增加。通过将分子识别转化为密闭器皿中气体的生成，便可实现目标物的检测及含量的推算。

Zhang Weiqi等利用竞争免疫法实现了便携式气压计对AFB的高灵敏检测。具体方法为：首先将AFB的包被抗原AFB-BSA吸附在微孔板底部，再同时加入样品提取液和AFB的mAb。当样品液中不含有AFB时，mAb与微孔板上的包被抗原特异性结合，接着加入二抗标记的金-铂核壳纳米粒子（Au@PtNPs-IgG），Au@PtNPs-IgG与mAb特异性结合，由于Au@PtNPs具有过氧化氢酶活性，在该体系中加入HO后，HO被Au@PtNPs催化分解产生O，利用手持式气压计记录体系的压力，得到较高的压力信号；当样品液中含有AFB时，mAb与AFB的结合能力强于其与AFB-BSA的结合能力，此时，微孔板无法捕获Au@PtNPs-IgG，加入HO后，HO无法被分解，导致检测体系无压力信号的增大。该研究中，气压计的信号值与AFB质量浓度成反比。在最优条件下，AFB线性范围为0.09～16.0 ng/mL，且其检出限为0.03 ng/mL。

2.6 基于智能手机的便携式生物传感器

当今社会，因为智能手机的普遍存在且便于携带，研究者们将智能手机也运用到了生物传感器的构建当中。Jin Birui等开发了一种新的LFSs，用于同时检测水样中的Hg、OTA、沙门氏菌。具体方法为：首先合成具有红、绿、蓝发射峰的UCNPs，作为产生荧光信号的检测探针；其次将不同的UCNPs分别修饰在不同目标物的适配体上装载于样品垫上，将不同目标物的适配体互补链固定在3 条检测线上。向样品垫上加入样品，若样品中没有目标物时，UCNPs修饰的适配体与测试线上互补链结合，将LFSs插入便携式阅读器，智能手机上软件所显示的检测线荧光强度强；相反，智能手机上软件所显示的检测线荧光强度弱。该生物传感器使我们能够使用LFSs同时检测和量化多个目标，最终从智能手机上所显现的相应色带的颜色强度得出结果。该方法可在30 min内完成检测，其中对OTA的检出限为3 ng/mL。

2.7 基于微流控芯片的便携式生物传感器

在众多的便携式生物传感器构建当中，微流控芯片也是近些年来备受亲睐的便携式检测的理想工具。微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程的微型生物化学分析系统，是检测细胞、核酸、蛋白质及其他生物样品重要手段，具有方便快捷、灵敏且成本低等优点，已被广泛应用于便携式快速检测中。

Ma Yanli等利用DNA水凝胶和微流控芯片构建了便携式生物传感器实现了对AFB的检测。具体方法为：用两条聚丙烯酰胺-DNA链和AFB适配体构建成DNA水凝胶，在其腔体装载PtNPs。加入含有AFB的样品液后，AFB与适配体特异性结合使适配体构象变化，导致水凝胶迅速瓦解，释放出PtNPs，将上清液加入到微流控芯片中，PtNPs催化HO分解生成O，通过气体驱动芯片中的红色墨水移动，通过测量红色墨水移动的距离计算出样品中AFB的浓度。用该方法对啤酒中AFB进行检测，检出限为1.77 nmol/L。

2.8 其他便携式生物传感器

除了上述所提到的LFSs、PGM、pH计和微流控芯片等以外，研究者们还用到了其他设备对真菌毒素进行检测。

便携式阻抗探测器也受到了研究人员的关注，因其体积较小、便于携带、结果读出快捷方便被用来构建生物传感器以实现对毒素的检测。Goud等设计了一种电化学阻抗探测器传感器用于检测AFB。该检测是以丝网印刷碳电极（screen printed carbon electrodes，SPCEs）为基底进行的，通过重氮盐共价结合将AFB的适配体固定在电极表面，AFB与适配体结合导致阻抗发生变化，最后通过阻抗探测器结果变化进而判定AFB的质量浓度。同时在该研究中，研究人员还对两个适配体序列（seq A和seq B）的分析性能进行了比较，结果显示，使用seq A和seq B对AFB的检出限分别为0.12 ng/mL和0.25 ng/mL。研究者们为实现更快捷、方便的检测，通过3D打印技术将电极制成USB兼容传感器。Li Zhanming等提出了一种基于丝网印刷交错微电极（screenprinted interdigitated microelectrodes，SPIMs）和阻抗探测器相结合的电化学生物传感器，实现了对水稻中AFB低成本、高选择、高灵敏度检测。采用3D打印技术制成USB兼容传感器，在该USB传感器内部设计有一凹槽，凹槽中放置SPIMs，并在其表面修饰AFB的mAb，最后用BSA对其进行封闭。AFB与mAb的结合将导致阻抗发生变化，在检测中将该USB兼容传感器与阻抗探测器相结合可实现样品中的AFB便携式检测，在最佳条件下，该方法对AFB的检出限为5 ng/mL，总检测时间小于1 h。

光电化学生物传感器由于独特的优势，已经得到了广泛的研究和应用。但是电化学工作站和光源的需求限制了便携式光电化学生物传感器的发展。Hao Nan等开发了一种便携式太阳能驱动的光电化学可视化生物传感器用于检测玉米汁中OTA，该生物传感器是在一个小的铟锡氧化物电极上制作的，它分为两个模块，一个是检测模块，另一个是参考模块，每个模块由两个区域组成，分别为光电传感区域和视觉区域。光电传感区域采用三维石墨烯水凝胶纳米复合材料构建，视觉区域采用电致变色材料普鲁士蓝构建。当OTA质量浓度变化时将导致电子迁移量变化从而引起视觉区域颜色变化，通过这两个模块上的视觉区域的色度比得到检测物的质量浓度。线性检出范围为1～500 ng/mL，检出限为0.29 ng/mL。该传感器由于其高精度和便携性，将为生物分析、食品检测等领域的研究带来光明的前景。

Joshi等构建了一种利用便携式表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）生物传感器，对啤酒中DON和OTA进行竞争性免疫测定。SPR即为一种光入射金属表面产生的物理光电现象，通过测折射率进而判定目标物含量的技术。应用该方法对啤酒中DON、OTA进行检测，得出DON检出限为17 ng/mL，OTA的检出限为7 ng/mL（或浓缩75 倍后OTA检出限为0.09 ng/mL）。该方法可用于啤酒中DON现场检测，无需预浓缩；而啤酒中的OTA则需要额外的富集步骤，该方法不太适用于OTA的现场检测。

表3整理了上述基于便携式生物传感器的毒素检测方法。

表3 基于便携式生物传感器的毒素检测方法Table 3 Mycotoxin detection method based on portable biosensor

3 结 语

真菌毒素的广泛存在使食品安全问题频发。传统的真菌毒素检测方法大多需要大型仪器设备、专业人员和成本偏高的材料，这些因素极大地限制了这些检测方法在现场检测中的推广使用。因此开发操作简单、快速、灵敏且可用于即时检测真菌毒素的便携式生物传感器十分重要。便携式生物传感器的构建是现场即时检测的必然趋势。

目前不断出现的便携式生物传感器在检测真菌毒素方面取得了很好的成就，但是仍存在一些问题，有待进一步的完善：1）在食品当中往往会存在有两种或多种真菌毒素，在检测不同真菌毒素时，会因检测所需条件的差异而导致检测程序复杂化，因此开发多种真菌毒素同时检测的生物传感器很有必要；2）食品基质复杂，在真菌毒素的检测当中会带来影响，因此，需要进一步提高这些传感器的抗干扰能力。

未来的便携式检测仪器将往更灵敏、抗干扰能力更强、质量轻、功能丰富、电池工作时间长、数据存储方便、价格便宜、有防撞防水外壳、在户外显示清晰的方向发展，以满足实际生活中对样品即时检测的需要。总之，广大研究者们需要拓宽思维，实现多学科的结合，从而构建出操作简单、快速、灵敏、抗干扰的便携式生物传感器，实现对真菌毒素的现场即时检测。