冰晶形貌对反复冻融肉体系稳定性影响的研究进展

崔晓颖，赵鑫琦，刘春云，李 楠，喻倩倩，彭新颜*

（烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005）

我国作为世界上最大的肉类生产消费国，低温冷冻肉始终是调节我国肉类市场的主要产品。然而在实际生产、贮藏和销售过程中由于冷链体系不健全，使得冷冻肉在食用前不可避免地经历反复冷冻-解冻（反复冻融）过程。据统计，我国冷冻肉制品由于反复冻融等原因导致的汁液流失率高达8%～9%，每年造成肉品行业经济损失已超过450亿 元。近年来，国内外关于冷冻对肉品质劣变影响的研究深入而广泛，比较有说服力的观点主要集中在以下几方面：冻融过程中冰晶的反复形成会引起冰晶数量减少而体积增大，“长大”的冰晶一方面会对肉体系产生机械破坏作用，另一方面会诱发脂质和蛋白氧化变性连锁反应，造成肉蛋白骨架“崩溃瓦解”，最终导致产品在多汁性、口感、质地和颜色等方面的商品价值丧失。因此，了解冰晶对冻融肉体系稳定性的影响及其本质，可为冷冻肉品质控制提供理论指导，对推动我国冷冻肉产业的健康发展具有重要意义。

1 冰晶对肉体系品质的影响

1.1 冰晶形成的影响因素

食品冷冻形成冰晶是一个典型的热力学过程，包括细胞内和细胞外水的结晶、水通过细胞膜和细胞内膜系统运输、冰核形成和冰核生长等方面。冰核的形成是水分子在平衡温度以下的过冷沉淀，系统通过成核发展到热力学平衡。冰核的形成和生长速率决定了冰晶的数目、大小和位置，同时受冻结速率、过冷程度、食品体系中水分分布、溶质性质和浓度等方面的影响。快速冷冻时，水分子在过冷状态持续时间短，能很快通过最大冰晶生成带，通常形成的冰晶小且分布均匀，接近肉制品中水分的分布。而低速冷冻时，有足够的时间让液态水向正在生长的晶体扩散，造成组织间的冰晶体愈长愈大。此外，成核温度也是影响细胞内冰晶形成的关键因素，成核温度越低，细胞内成冰率越高。

食物成分组合在一起形成复杂的组织基质，将大部分的水包围其中，成为水和热传递的障碍。冻融过程中冰晶的反复重组会不断造成细胞膜损伤，如当温度升高时，细胞内的冰晶融化成水，在蒸汽压差的驱动下，水分透过细胞膜分散到细胞间隙中。当温度下降时，受热动力学效应的影响，首先是极少部分的水分子有规则地结合在一起形成晶核，周围的水再有序地不断结合到晶核上，组织内小冰晶变成大冰晶，表面能降低，发生重结晶，逐渐形成“大体积形貌”冰晶。根据普朗克公式，冻结速率主要受冻结物厚度、冻结介质温度和传热系数的影响。如肉制品与液体介质直接接触能引起更多的热交换，从而提高传热系数，加快冷冻速率。实际上，肉体系组成和冰晶形成过程都十分复杂，只有综合利用热力学、传质传热学、结晶动力学，结合显微图像建模才能全面解释和描述冰晶生长过程。另外，分形维数作为图像处理的重要工具，能够对具有相似特征、无规则、繁杂、随机形状的冰晶进行定量分析。

1.2 冰晶对肉体系微观结构的影响

冰晶反复形成会造成肉体系细胞和组织的不可逆损伤，直接影响其微观结构。冻结时细胞外冰的形成使溶质浓度提高，细胞渗透脱水，导致细胞收缩和显微结构破坏。特别是在形成胞外大尺寸针状冰晶的情况下，会对细胞膜和组织产生明显的机械胁迫，严重破坏肌肉组织的完整性。如线粒体空泡化、肌节缩短以及Z线和M线错位、断裂、消失，从而影响肉制品的纹理和结构。Bjorg及Zhang Bin等研究发现，反复冻融肉中冰晶的分布、取向、颗粒大小和形状不断发生变化，导致肉蛋白的聚集、交联、重排和不可逆变性，致使肌原纤维破裂和结构破坏、结缔组织松散。随着温度的波动，小的冰晶融化再结合后会形成更大、更不规则的冰晶体，导致冰晶体积和平均尺寸增大。随着冻融及贮藏时间延长，肉样品中的冰晶不断生长并在体系中重新分布，小冰晶表面扩散并依附于大冰晶，促使更大的冰晶继续形成。由于冰的生长是各向异性的，生长速度不同，导致细胞膜完整性破坏加剧。在冻融过程中形成的“巨大冰晶”会挤压和破坏肌纤维的微观结构，促使肌纤维之间间隙增大，肌节出现扭曲变形，最终造成产品的可接受程度降低。Zhang Bin等研究表明，冰晶对细胞产生极大压力后，也会影响解冻后微观结构的恢复，最终导致细胞结构物理损伤和严重变形。Wei Huamao等发现，冷冻扇贝随着贮存时间的延长Z线逐渐被破坏，肌浆网膨胀，肌肉组织结构损伤。Zhang Mingcheng等也证实，冻融肉在冰晶的胁迫下，肌原纤维逐渐沿Z线出现断裂、变窄，粗丝与细丝重叠处被破坏，M线变得模糊。

1.3 冰晶形貌对肉制品汁液流失的影响

持水能力与肉制品品质（如色泽、质构、多汁性和嫩度）直接相关。肉制品经反复冻融后的变化存在多样性和复杂性，其中冰晶“长大”产生的物理挤压和刺破作用是造成冷冻肉汁液流失的主要原因。细胞膜在维持细胞的完整性和渗透压方面起着重要的作用，“大冰晶”的形成会对细胞膜造成损伤，改变其通透性，导致细胞内容物的溢出和细胞间水分流失。研究证实，冰晶的形貌和位置分布会直接影响体系水分态变和保水效果。Zhang Bin等研究表明，随着贮藏时间的延长，冰晶尺寸不断增大，肌丝和肌原纤维聚集的累积效应致使细胞收缩、细胞间隙增大，改变了丝状间隙的持水能力，降低了肉的保水性，结果造成产品组织软塌。Coleen等发现，冰晶形成后肌纤维的间距随之改变，最终造成原有空间容纳的水分子流失，降低了肉的保水性。冰晶的形成会破坏肌动蛋白、肌球蛋白、肌钙蛋白的结构，削弱Z线附近的I带，导致肌节收缩失水。Li Fangfei等研究表明，冻融循环导致不易流动水向自由水转变，这与冻融过程中水分的再分配和细胞外冰晶的形成使凝胶结构发生聚集有关。Cai Luyun等也证实，冷冻贮存导致样品肌纤维排列松散、损伤严重，甚至出现凹坑和裂缝，造成一定程度的失水。

冰晶的形成和重新分布引起的蛋白质氧化变性和构象改变是水分转移和流失的另一个主要驱动力。冻融循环过程中由于冰晶的生长造成的蛋白变性会使其构象拉伸或压缩，埋藏于内部的疏水基团暴露，蛋白与水结合位点数量减少，而氧化使内部水分在渗透压的作用下更容易迁出。肌细胞中的水分主要靠肌原纤维蛋白（myfibrillar protein，MF）来维持，冰晶的生长和再结晶导致了蛋白氧化变性、构象和空间结构的显著改变，从而削弱了水和蛋白质大分子之间的相互作用，降低了肉制品的持水能力。Cheng Shasha等也证实，蛋白氧化会造成水分迁移流失，使得肉制品的多汁性和嫩度变差。Ali等研究表明，在冰晶的挤压下，肌球蛋白和肌动蛋白发生氧化变性和结构改变，鸡肉制品的色泽和持水能力发生劣变。肉制品在多次冻融循环作用下横向弛豫时间显著延长，水的流动性增强。融化的冰晶由于细胞膜破裂、肌肉结构损伤和蛋白氧化变性而无法重新与肌肉结合，成为汁液流出，造成肉制品持水能力下降。

1.4 冰晶生长对反复冻融肉主要品质指标的影响

1.4.1 质构

冰晶的生长会影响肉体系内部组织结构，加速破坏肌原纤维的完整性，使其质构特性发生改变，造成品质劣变。凝胶质构在肉制品加工中决定了产品的口感、保水性及流变学等特性，直接影响产品品质。作为肉中主要的蛋白质，MF维持着肉制品紧凑而均匀的三维凝胶结构。研究发现，MF样品的凝胶强度随着冻融循环次数增加而降低，这可能是冰晶的生长导致蛋白氧化变性、结构破坏、成胶能力降低，同时凝胶网络变弱和纤维间空隙的收缩也会导致蛋白持水能力降低。嫩度也是决定肉品质的主要因素，Kim等证实，胞外“大冰晶”的形成破坏了细胞结构，将肌纤维撕裂，导致组织变软、嫩度上升。另外，胞内“小冰晶”的形成也会引起蛋白酶的释放，从而加速冻融循环牛肉制品嫩度的提升。研究发现，对肌原纤维的轻微损伤有助于提升肉的嫩度，然而当损伤严重时，由于保水能力的降低，剪切力增加，嫩度降低。Passakorn等认为，虾在冻融循环过程中剪切力增加、嫩度降低、肌肉纤维变得更紧实，这与滴水损失增加有关。冻融过程中水从肌肉中流失，肌肉纤维变得更加集中，形成的聚集体导致组织结构更坚硬，剪切力增加。Wang Bo等发现，随着冻融循环次数的增加，肉饼硬度先上升后下降，黏结性、咀嚼性和弹性均显著降低，这可能与冻融过程中冰晶生长引起的汁液流失有关。Chen Qingmin等也证实，由于反复冻融过程中牛肉中水分含量的降低，导致硬度、嫩度、咀嚼度升高，但弹性降低。Yang Fang等研究发现，冷冻过程中硬度与剪切力变化趋势相似，都随着贮藏时间的延长不断降低，表明冷冻过程中河豚鱼片发生微观结构破坏和质地软化。Natchaphol等发现，随着贮藏时间的延长，产品硬度、咀嚼性、内聚性、胶黏性都出现先升高后降低且弹性不断降低的趋势。

1.4.2 pH值

pH值的变化可影响肉的嫩度、多汁性、颜色、保水能力和货架期。但冻融循环过程中pH值的变化既有升高也有降低现象。pH值的降低通常归因于两个方面，冰晶“长大”产生物理挤压和刺破作用，肌肉的完整性遭到破坏，一方面造成肌肉中糖原分解，伴随脂肪溶解、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）等酸性产物含量增加；另一方面蛋白质变性导致肌动蛋白收缩和氢离子的释放，影响了组织内的酸碱平衡。另外，反复冻融过程中肉体系汁液流失增多，剪切力增大，肌纤维开始断裂，蛋白的完整性遭到破坏，微生物酶将蛋白质和核苷酸分解，造成三甲胺等碱性化合物累积，使pH值升高。越来越多的研究证实，随着冰晶形成次数的增加，肉体系蛋白变性降解产生多种氨基酸，当酸性氨基酸含量高于碱性自由氨基酸时，pH值就会降低，反之则升高。如Cai Luyun等研究发现，鱼类在贮藏期间pH值上升是鱼肉中的微生物生长、繁殖并产生蛋白酶使鱼肉中的蛋白质、氨基酸等含氮物质分解及氧化变性所致。Zeynab等也发现，龙胆鱼片贮藏过程中随着冷冻时间的延长pH值升高；Priyadarshini等也证实，罗非鱼在冷冻过程中pH值先略降低然后再升高；Cheng Shasha等的研究也表明，牛肉在冰晶反复形成过程中，随着冻融次数的增加，肉样品pH值呈现显著下降的趋势，这可能是肌肉中水分流失引起的溶质浓度增加以及蛋白质变性引起的氢离子释放所致。

1.4.3 颜色

低温冷冻是一种保持肉制品营养价值、延长货架期、提高产品品质和安全性的常见方式，但反复冻融过程中波动的温度也会促进羰基化合物、丙二醛或其他氧化产物的产生，加速肉的颜色劣化，降低红度（*值），并提高高铁肌红蛋白水平。Wang Bo等研究表明，在经过5个冻融循环后，肉饼*值显著降低，亮度（*值）和黄度（*值）显著升高。一般*值的变化与肌红蛋白的氧化、还原过程有关，*值显著升高可能是冻融循环过程中温度波动导致脂肪氧化造成；此外，冻融过程中肉饼表面积累了大量水分，导致肉饼的*值增大，脂肪氧化和肌纤维收缩也能导致*值升高。

1.4.4 微生物

反复冻融过程中微生物数量和种类总体都随着贮藏时间的延长不断增加，低温冷冻可以有效抑制微生物繁殖，降低酶活性，但融化后部分微生物活力又恢复，且营养丰富的维生素、矿物质和蛋白质等内容物的渗出为微生物生长繁殖提供了充足的营养物质，使嗜冷菌的数量明显增加。另外，微生物数量减少的原因也可能是冰晶尺寸的增加导致微生物的微观结构受到不可逆的损伤，或是冰晶的形成和温度波动产生的热冲击所致。研究发现，肉制品在贮藏过程中微生物数量不断波动，如肉食杆菌属、索丝菌属和漫游球菌数量增加，冷杆菌属和假单胞菌数量先增加后减少，不动杆菌属数量减少。其中假单胞菌是冷冻条件下常见的肉类腐败菌，长期贮存过程中会造成肉样品表面发黏、产生难闻气味。

1.4.5 风味

冷藏过程中随着微生物数量的增加，挥发性脂肪酸和氨基酸的氧化作用使肉体系风味随着贮藏时间的延长而改变，一旦超过可接受的阈值，就会产生消费者难以接受的腐臭味和酸味。Yu Dawei等用电子鼻对冷冻贮藏后的河豚进行分析发现，冷冻时间越长、样品气味特征变化越大，且冰晶的反复形成、内源蛋白水解和氧化预处理对冷冻河豚的风味影响较大。Azarifar等观察到由于蛋白质的分解和非蛋白化合物的积累，样品在贮藏第6天的特征气味达到了不可接受的水平，这与生化学检测结果相印证。

2 冰晶对肉体系氧化稳定性的影响

2.1 冰晶对肉体系脂质氧化的影响

真实的肉体系成分复杂，冰晶的反复形成不仅会破坏细胞膜和细胞器，损伤的肌细胞还会释放出促氧化剂，快速启动脂肪氧化。冰晶引起的肌肉组织微结构损伤可能导致促氧化因子（氧化酶、自由基和血红素）的释放及细胞内容物（脂肪酶和磷脂酶）的流出，参与并加速脂质氧化反应。脂质氧化产物包括自由基和氢过氧化物等，它们很容易进一步分解为次级氧化产物，如戊醛、己醛、异呋喃和丙二醛，最终导致产品出现酸败味及肉表面变色。研究发现，冰晶的形成和生长会对肉体系组织结构、肌纤维和细胞膜造成破坏，使酶类物质释放，导致丙二醛和胆固醇氧化产物的形成，以及挥发性羰基、醇和酸的积累，最终产生不良的异味和发生酸败，而且还会产生潜在的前体或催化剂，从而形成活性氧（reactive oxygen species，ROS），进一步导致肉类品质劣变。如Huang Li和Young等的报道也证实，肉类细胞膜中含有大量的多不饱和脂肪酸，脂质氧化会释放ROS以及丙二醛、羟基壬烯醛和其他副产物，促进了蛋白氧化降解和系列生化反应，因此，脂质氧化被认为是引起肉及肉制品营养损失和品质劣变的根本原因之一。

过氧化值（peroxide values，PV）以及硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）、挥发性盐基总氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）和FFA含量作为衡量肉体系脂质氧化的重要指标，被广泛用于评价肉制品的酸败程度。冰晶的反复融化、形成及重结晶使小冰晶不断依附于大冰晶，引起冰晶数量减少、体积增大，特别是细胞外冰晶的大量形成会造成细胞结构的机械损伤，诱发并加速脂肪水解及脂质氧化，使肉制品出现TVB-N和TBARS含量升高，而PV出现升高或先升高后下降等氧化酸败的趋势。在肉体系中，氧化过程是由不同类型的脂类和蛋白质、肉类色素以及各种氧化产物的形成而引起的复杂反应。如脂质氧化和肌红蛋白氧化是相关联、交互作用的，肌红蛋白氧化提供脂质氧化所需的HO，而脂质氧化产物会改变肌红蛋白氧化还原的稳定性，进而促进肌红蛋白氧化，并通过共价修饰与肌红蛋白形成加成物，也是影响肉体系稳定性的因素。

2.2 冰晶对蛋白氧化变性和构象的影响

研究证实，反复冻融过程形成的“大体积”冰晶诱导的蛋白氧化变性是造成肉体系品质劣变的另一个重要原因。天然蛋白主要靠氢键、疏水作用、范德华力、静电相互作用和二硫键等作用力维持稳定。冰晶的生长破坏了细胞的完整性，释放出血红素铁、三甲胺氧化物、脱甲基酶和其他过氧化物质，导致线粒体和溶酶体酶的泄漏，加速了蛋白氧化，进而改变蛋白质的表面电荷、溶解性、亚基的大小/组成、二硫键数量、亲水/疏水性及分子质量分布。近年来，肉蛋白氧化相关研究逐渐引起了学者们的重视，蛋白质分子在ROS作用下，通过直接诱导主链和侧链氧化、生成羰基衍生物、形成蛋白质交联聚合物、促使肽链断裂或共价修饰从而改变蛋白质结构（图1）。同时在冷冻过程中蛋白质发生的变性主要有两种，一种是在冰晶的挤压及氧化作用下互相靠拢并聚集变性（图2A），另一种是蛋白质分子间发生构象重排、分子内聚集，多肽链展开变性（图2B）。有研究发现，冰晶胁迫的氧化变性会导致肉蛋白天然构象降解，-螺旋和-折叠结构被破坏，蛋白网状结构从致密变得松散，丧失分子内部原有的高度有序性，导致MF的坚实骨架也随之“溃散解体”。Cao Yungang等报道称，由于MF在贮存期间发生氧化变性，非共价和共价分子键的改变破坏了蛋白质的结构和构象，导致蛋白质聚集和降解、-螺旋结构破坏、疏水结构域暴露，MF的网络结构也随之改变。Li Fangfei等研究表明，冻融循环会使二级结构中的-螺旋和-折叠结构含量减少；GAO Wenhong等也发现，部分-螺旋和-折叠结构转变为-转角和无规卷曲。冰晶造成蛋白羰基和氨基之间氢键的破坏以及氨基酸间静电相互作用减弱，部分蛋白残基与水分子接触，形成新的氢键，进而导致蛋白质的聚集。蛋白质的三维结构主要是由氢键、极性残基水合作用以及疏水相互作用来保持。一旦这些力受到破坏，蛋白质的三维结构随之发生改变，蛋白质生理活性就会丧失。如三级结构检测中显示色氨酸荧光强度显著降低，表明色氨酸残基暴露在极性环境中，疏水相互作用导致蛋白质发生折叠，形成蛋白聚集体。冰晶的反复形成导致肌肉蛋白的化学和物理环境改变，从而引发溶解度、游离氨基酸含量、巯基含量和Ca-ATP酶活力降低，羰基含量和表面疏水性提高，电泳条带变浅、聚集或消失，粒径显著增加等问题（表1）。

图1 蛋白氧化过程[74]Fig.1 Oxidation process of proteins[74]

图2 蛋白质冷冻凝聚变性模型（A）和蛋白质开链变性模型（B）[34]Fig.2 Freeze-induced protein denaturation model (A) and protein open-chain denaturation model (B)[34]

表1 冰晶反复形成对肉体系主要氧化稳定性指标的影响Table 1 Effect of repeated ice crystal formation on major oxidation stability indexes in meat product system

3 结 语

综上所述，冷冻过程中冰晶的反复形成对肉体系的细胞结构和理化性质都有较大的影响，最终引起肉及肉制品感官品质、营养价值、功能性质的下降。越来越多的研究证实，冻融过程中形成的冰晶大小不等、分布不均且在肌纤维中会多次重新分配，这会动态影响肌肉组织中冰晶的大小和位置。由于反复的结晶、融化和重结晶使组织内小冰晶不断附着于大冰晶，最终导致冰晶数目减少而尺寸增大。“大体积”冰晶形貌会严重破坏组织的超微结构，造成汁液流失，致使肉体系溶质（蛋白质、碳水化合物、脂类、维生素和矿物质等）浓度增加，促氧化因子释放，线粒体和溶酶体释放到肌浆中，产生复杂、相互关联的生化链锁反应，从而加剧氧化进程和蛋白质骨架“溃散解体”，破坏系统的内稳态。其中，“冰晶形貌”的变化是造成肉体系品质劣变的主要因素，鉴于此，要降低反复冻融对肉制品的危害，最有效的方法是掌握冰晶的形成规律，防止产生“大体积”冰晶，探索形成“细小均匀”冰晶的有效方法。例如添加抗冻蛋白、抗氧化剂、蛋白多肽、蛋白质粉、保水剂，通过电场、磁场、超声干预，以及减少冻融次数、控制温度波动、结合气调包装、采用快速冻结等方式，以改善反复冻融对肉及肉制品的负面影响。另外，为了提高肉制品品质，除了采取传统的流动水、冰水、空气和冰盐水解冻外，采用内部加热式解冻、低频电流解冻、电介质高频解冻、高压解冻、微波或红外辐射解冻也是未来的发展方向。