葡萄酒干物质和花色苷对人体肠道菌群的影响：基于体外模拟发酵法

岳文秀，吴璐璐，韩富亮,2,3,*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100；3.西北农林科技大学合阳葡萄试验示范站，陕西 合阳 715300）

肠道菌群是人体胃肠道内微生物的统称，主要由细菌组成，也包括少量古细菌、病毒（主要是噬菌体）和真核生物（主要是酵母菌）。健康成年人的肠道中存在约10个微生物，主要属于厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia），其中Firmicutes和Bacteroidetes是优势菌群，占细菌总量的90%以上。

正常情况下，肠道菌群处于动态平衡，与人体免疫系统、代谢系统形成复杂的共生关系，直接或间接影响宿主健康。但是该平衡可被多种因素打破，造成菌群失调。菌群失调与代谢性疾病、免疫性疾病以及精神类疾病密切相关。饮食是造成菌群失调最主要的因素之一。改变饮食结构可直接影响肠道菌群的组成和结构，进而通过肠-肝轴、肠-脑轴等多种途径间接影响宿主健康。

花色苷是一类具有苯并吡喃结构的类黄酮化合物，广泛存在于自然界。红葡萄酒中含有丰富的花色苷。年轻的欧亚种红葡萄酒中游离的花色苷质量浓度可达2 000 mg/L，以二甲花翠素-3--葡萄糖苷含量最多。人体饮用葡萄酒后，葡萄酒花色苷主要在结肠中被肠道菌群代谢吸收。目前多酚类物质的益生功能已在多种实验模型中得到证实，例如原花青素可通过影响肠道菌群的结构和多样性显著改善高脂饮食造成的小鼠肥胖，但是关于葡萄酒花色苷对肠道菌群的影响尚不明晰。

本研究采用体外方法将葡萄酒花色苷与肠道菌群共培养，分析花色苷在消化吸收过程中对肠道菌群结构、多样性及功能的影响，为进一步研究花色苷的生理活性功能提供理论基础，为提高葡萄酒的营养价值和促进葡萄酒健康饮用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样为来自新疆的赤霞珠红葡萄酒（2015年），酒样中还原糖、总酸、挥发酸、总硫、游离硫、总酚质量浓度和酒精度具体数值见表1。

表1 酒样基本理化指标Table 1 Physicochemical properties of the wine sample tested in this study

十二水合磷酸氢二钠、氯化钾、LA0740-250g厌氧培养基 北京索莱宝科技有限公司；氯化钠、磷酸二氢钠广州市金华大化学试剂有限公司；厌氧混合气体（10%H、10% CO和80% N）、高纯氮气、液氮 杨凌建一工业气体供应站；乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱级）、乙酸（色谱级） 杨凌天成化玻站；二甲花翠素-3--葡萄糖苷标准品（纯度≥95%） Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

YQX-II厌氧培养箱 上海跃进医疗器械公司；SW-CJ-IFD超净工作台 苏州安泰气体技术有限公司；TGL-18M离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；SX-500高压灭菌锅 日本TOMY公司；KQ-250DE超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪和AUX320分析天平 日本岛津公司；FD-1C-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱法检测葡萄酒花色苷

参照Yang Ping等的方法并稍作修改。取酒样1.5 mL经0.22 μm有机相滤膜过滤，直接进行高效液相色谱分析。流动相A：（水）∶（乙腈）∶（甲酸）＝32∶10∶5；流动相B：（水）∶（乙腈）∶（甲酸）＝20∶20∶5。色谱柱：Kromasil 100-5-C（250 mmh4.6 mm，5 µm）；梯度洗脱程序：0～15 min，0～10% B；15～30 min，10%～20% B；30～45 min，20%～35% B；45～46 min，35%～100% B；50～51 min，100%～0 B；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长520 nm；进样量20 μL。花色苷定量分析采用外标法，所有花色苷质量浓度表示为二甲花翠素-3--葡萄糖苷当量。

1.3.2 肠道菌群培养

实验当天收集健康志愿者（1 名）（肠道状态良好，至少3个月未服用过抗生素相关药物）的粪便，立即称质量。在厌氧培养箱中，粪便样品与磷酸盐缓冲液（0.24 g/L KHPO、1.44 g/L NaHPO、8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl）按照1∶9（/）的比例混合均匀，纱布过滤，滤液在5 000 r/min、37 ℃条件下离心5 min。上清液与已灭菌的厌氧培养基以1∶9（/）的比例混合，37 ℃恒温避光厌氧无菌条件下培养24 h，模拟人体肠道环境。

1.3.3 模拟消化葡萄酒花色苷和二甲花翠素-3--葡萄糖苷

将赤霞珠红葡萄酒冷冻干燥至粉末。在厌氧培养体系中加入粉末状酒样，葡萄酒花色苷的质量浓度分别为42.14、21.07 mg/L和10.54 mg/L，依次设为高浓度组（A组）、中浓度组（B组）、低浓度组（C组），其中对照组不加酒样（D组），37 ℃厌氧避光培养24 h。在0、4、12、24 h时取样5 mL，于3 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min。取离心沉淀物，液氮速冻后放于－80 ℃冰箱暂存，用于16S rRNA测序。

在厌氧培养体系中加入二甲花翠素-3--葡萄糖苷标准品，质量浓度分别为50 mg/L和10 mg/L，依次设为高浓度组（E组）和低浓度组（F组），其中对照组不加标准品（D组），于37 ℃厌氧避光培养24 h。取样时间、取样量和样品处理方式与模拟消化葡萄酒花色苷一致。

1.3.4 肠道菌群多样性分析

试剂盒提取DNA，检测样本浓度质量合格后，选取肠道菌群基因组16S rRNA V3＋V4区作为扩增区域进行扩增建库。建库测序工作由北京百迈客生物科技有限公司负责。使用Usearch软件对序列在97%的相似度水平下进行聚类，获得分类操作单元（operational taxonomic units，OTU）。对OTU进行丰度分析和Alpha多样性（包括Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数和Coverage指数）计算，获得样本物种丰富度和均匀度信息。Chao1指数按照式（1）计算。

式中：为Chao1指数；为实际观测到的OUT数目；为只含有一条序列的OUT数目；为只含有两条序列的OUT数目。

ACE指数按照式（2）～（5）计算。

式中：为ACE指数；为多于“abund”条序列的OUT数目；为含有“abund”条序列或者少于“abund”的OUT数目；为表示所有低丰度（出现≤10 次）的物种中非singleton的比例；为只含有一条序列的OUT数目；为稀有物种变异系数的估算值；n为含有条序列的OUT数目；为稀有（丰度阈值小于或等于）物种数；、分别为1和0，表示群落中大于0的物种数。

Shannon指数按照式（6）计算。

式中：为Shannon指数；为实际观测到的OUT数目；n为含有条序列的OUT数目；为所有序列数。

Simpson指数按照式（7）计算。

式中：为Simpson指数；为实际观测到的OUT数目；n为含有条序列的OUT数目；为所有序列数。

Coverage指数按照式（8）计算。

式中：为Coverage指数；为含有一条序列的OUT数目；为所有序列数。

1.4 数据处理与分析

数据结果表示为平均值±标准差。利用统计分析软件SPASS 20.0进行单因素方差分析，数据采用Duncan’s多重比较检验，＜0.05认为具有统计学显著差异。

2 结果与分析

2.1 酒样中花色苷的种类分析

本实验酒样中，高效液相色谱仪共检测到9种花色苷，分别为花翠素-3--葡萄糖苷、花青素-3--葡萄糖苷、甲基花翠素-3--葡萄糖苷、甲基花青素-3--葡萄糖苷、二甲花翠素-3--葡萄糖苷、甲基花青素-3--乙酰化-葡萄糖苷、二甲花翠素-3--乙酰化-葡萄糖苷、甲基花青素-3--香豆酰化-葡萄糖苷和二甲花翠素-3--香豆酰化-葡萄糖苷。花色苷总质量浓度为150.51 mg/L，其中二甲花翠素-3--葡萄糖苷质量浓度最高（84.28 mg/L），占总花色苷的56.00%。酰化花色苷中，二甲花翠素-3--乙酰化-葡萄糖苷质量浓度最高（29.94 mg/L），占总花色苷的19.89%。

2.2 葡萄酒花色苷对肠道菌群的影响

2.2.1 Alpha多样性

Alpha多样性反映单个样品物种丰富度及物种多样性，有多个衡量指标：ACE指数、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数和Coverage指数。ACE指数和Chao1指数用于评价菌群丰度，Shannon指数和Simpson指数用于衡量物种多样性。ACE指数、Chao1指数和Shannon指数越高，Simpson指数越低，样本物种多样性越高。Coverage指数为各样文本库的覆盖率，其数值越接近1，表明样本测序结果越符合真实情况。表2为各组样本的Alpha多样性指数。可以看出，4 组样本的Coverage指数都接近1，说明测序结果可以代表样本的真实情况。培养24 h后，高浓度和中浓度组的ACE指数、Chao1指数、Shannon指数均显著高于对照组（＜0.05），且Simpson指数显著低于对照组（＜0.05）。表明葡萄酒花色苷能增加肠道菌群的物种多样性和丰富度，且高浓度和中浓度处理效果更好，呈现一定浓度效应。该结果与le Roy等的研究结果一致，即适当饮用红酒可以增加人体肠道菌群的Alpha多样性。

表2 葡萄酒花色苷对肠道菌群Alpha多样性指数的影响Table 2 Effect of wine anthocyanins on alpha diversity indices of intestinal bacteria

2.2.2 门水平上肠道菌群结构组分分析

如图1所示，肠道菌群主要由Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria组成，优势菌群为Proteobacteria和Bacteroidetes。这与先前报道的成年人群肠道菌群的主要组成一致。除Proteobacteria和Bacteroidetes外，处理组中其他菌门的平均总占比为55%左右，远高于对照组（低于30%），表明葡萄酒花色苷能有效增加肠道菌群物种多样性。

图1 门水平肠道菌群相对丰度柱状图Fig.1 Histogram of relative abundance of intestinal microbiota at phylum level

24 h时，高浓度组厚壁菌门/拟杆菌门的比值（Firmicutes/Bacteroidetes，F/B）显著低于对照组（＜0.05）（图2A）。0～24 h，高浓度组的F/B值从0.94降低至0.63，降幅达32.98%；而对照组的F/B值从0.30上升至1.64。中浓度和低浓度组F/B值与对照组变化趋势一致。F/B值过高与高脂饮食有关，且该比值与肥胖发生率呈正相关，被作为肥胖的有效生物标记指标。这表明较高浓度的葡萄酒花色苷可以调节宿主脂质代谢，有一定减脂减肥功能。

高浓度组样品的放线菌相对丰度在24 h内由16.58%降低至14.95%，降幅为9.83%（图2B）；对照组样品的放线菌相对丰度在24 h内由2.14%降低至0.46%，降幅为78.50%。由此可以看出，红葡萄酒中的花色苷可以减缓放线菌相对丰度降低的速度。

图2 门水平肠道菌群相对丰度变化Fig.2 Change in relative abundance of intestinal microbiota at phylum level

2.2.3 属水平上肠道菌群结构组分分析

如图3所示，对照组和处理组的肠道菌群主要由拟杆菌属（）、大肠埃氏菌属-志贺氏菌属（）、副杆菌属（）、韦荣球菌属（）、链球菌属（）、毛螺菌属（）、考拉杆菌属（）和普拉梭杆菌（）组成。

图3 属水平肠道菌群分布柱状图Fig.3 Histogram of relative abundance of intestinal microbiota at genus level

培养24 h后，高浓度组中和的相对丰度均显著低于对照组（＜0.05）。0～24 h，高浓度组的相对丰度由1.07%降低至0.36%，降幅为66.36%（图4A）；的相对丰度由0.18%降低至0.12%，降幅为33.33%（图4B）。而对照组中这两种菌的相对丰度均增加。是一种肠道致病菌，在某些条件下也可致病。二者均会导致糖尿病患者病情的恶化。花色苷可能通过破坏细菌细胞膜/细胞壁，促使其裂解死亡，从而抑制致病菌的生长。

图4 属水平肠道菌群相对丰度变化Fig.4 Change in relative abundance of intestinal microbiota at genus level

高浓度组和中浓度组乳杆菌属（）的相对丰度在0～4 h增加，24 h时相对丰度均显著高于对照组（＜0.05）（图4C）。对照组梭杆菌属（）的相对丰度在0～24 h由6.26%降低至0.40%，减少了93.61%，高浓度处理组的相对丰度由1.15%降低至0.18%，减少了84.35%（图4D）。是一种肠道益生菌，可利用精氨酸产生-鸟氨酸来促进肠黏膜形成，调节肠道黏膜稳态。而是已知的下唯一物种，除了能够将膳食纤维分解产生丁酸盐和其他短链脂肪酸，为肠上皮细胞提供能量外，还具有抗炎功能。高浓度葡萄酒花色苷处理减缓了和相对丰度的下降趋势，可能是由于乳杆菌属、双歧杆菌属等益生菌可以通过编码多种葡萄糖苷酶代谢花色苷，并以花色苷释放的葡萄糖苷作为营养物质促进自身增殖。与该结果类似，枸杞花色苷、越橘花色苷也能调节肠道菌群，提高、、和的相对丰度，降低和的比例。由此可推测，葡萄酒花色苷具有促进肠道有益菌增殖、抑制致病菌生长的潜力。

2.2.4 基因预测分析

图5为肠道菌群功能基因丰度图。在新陈代谢方面，处理组在氨基酸代谢、能量代谢、脂质代谢、辅助因子和维生素代谢以及外源性物质的降解与代谢方面有明显优势；对照组在碳水化合物代谢方面有明显优势。在遗传信息处理方面，高浓度组在转录、转化以及蛋白质的折叠、运输和降解方面优于对照组；中浓度组在转化方面优于对照组。在环境信息处理方面，低浓度组更加具有优势。

图5 京都基因与基因组百科全书分类柱状图Fig.5 Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis

2.3 二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷对肠道菌群的影响

2.3.1 Alpha多样性

如表3所示，高浓度组的Chao1指数显著高于对照组（＜0.05），ACE指数和Shannon指数也均高于对照组。低浓度组的Alpha多样性指数与对照组接近。该结果与葡萄酒花色苷基本一致，即较高浓度的花色苷标准品比低浓度更能增加样本物种的丰富度和多样性，表现出浓度依赖性。这表明葡萄酒花色苷混合物对肠道菌群多样性的影响可能主要是由于二甲花翠素-3--葡萄糖苷的存在。相较于葡萄酒花色苷，花色苷标准品对Alpha多样性指数的影响程度整体较低，或许是葡萄酒花色苷中存在基质效应，因为葡萄酒中少量的糖、酸以及多酚物质也可对肠道菌群的多样性产生影响。

表3 二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷对肠道微生物Alpha多样性指数的影响Table 3 Effect of wine malvidin-3-O-glucoside on alpha diversity indices of intestinal microbiota

2.3.2 门水平上肠道菌群结构组分分析

根据门水平下的物种分布柱状图可知（图6），样品的肠道菌群主要由Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria组成，优势菌群为Firmicutes和Bacteroidetes。

图6 门水平肠道菌群丰度柱状图Fig.6 Relative abundance of intestinal microbiota at phylum level

如图7所示，高浓度组的F/B值在24 h内从4.17降低至1.65，降幅为60.43%；对照组的F/B值在24 h内从1.65上升至1.94。24 h时，高浓度组的F/B值低于对照组，Actinobacteria的相对丰度高于对照组，但差异均不显著（＜0.05）。该结果与葡萄酒花色苷处理的结果基本一致，即较高浓度的花色苷在降低F/B值、促进Actinobacteria增殖方面效果更好。

图7 门水平肠道菌群相对丰度变化Fig.7 Change in relative abundance of intestinal microbiota at phylum level

2.3.3 属水平上肠道菌群结构组分分析

如图8所示，在属的水平上，3 组样品中肠道菌群丰度前10的物种为拟杆菌属（）、大肠埃氏菌属-志贺氏菌属（）、挑剔真杆菌（[]__）、梭状芽胞杆菌（___）、克雷伯氏菌（）、普拉梭杆菌（）、链球菌属（）、考拉杆菌属（）、乳杆菌属（）、副拟杆菌（）。

图8 属水平肠道菌群分布柱状图Fig.8 Histogram of relative abundance of intestinal microbiota at genus level

高浓度组的相对丰度在0～4 h从7.45%上升至14.60%，在4～24 h从14.60%降低至4.70%（图9A）。对比0 h和24 h的相对丰度，高浓度组的共降低了36.91%。对照组的相对丰度在0～24 h一直降低，从10.40%降低至5.32%，共降低了48.85%。在0～4 h内高浓度组的相对丰度由2.28%上升到2.42%，在4～12 h由2.42%降低至0.73%，共降低了67.98%。对照组的相对丰度在0～24 h内一直降低，由3.71%降低至0.51%，共降低了86.25%（图9B）。表明在营养充足的条件下，高浓度二甲花翠素-3--葡萄糖苷可以促进这两种菌的生长。参与人体糖代谢，具有治疗糖尿病和胰岛素抵抗的潜力。

图9 属水平肠道菌群相对丰度变化Fig.9 Change in relative abundance of intestinal microbiota at genus level

2.3.4 基因预测分析

在新陈代谢方面，高浓度组在氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢有优势，低浓度组在脂质代谢、其他次生代谢产物的生物合成、核苷酸代谢方面有优势（图10）。在遗传信息处理方面，处理组在转化、复制和修复方面更有优势。在环境信息处理方面，高浓度组在膜运输方面更有优势。

图10 KEGG分类柱状图Fig.10 KEGG pathway analysis

3 结 论

葡萄酒中的花色苷具有增加肠道菌群多样性、调节肠道菌群结构的作用。具体表现为可以促进Bacteroidetes和Actinobacteria的生长，抑制Firmicutes生长；同时促进乳杆菌和梭杆菌等益生菌生长，抑制和等致病菌的增殖，提高人体肠道的新陈代谢能力。

二甲花翠素-3--葡萄糖苷对和的生长有促进作用，这两种有益菌均有助于改善糖脂代谢紊乱。二甲花翠素-3--葡萄糖苷作为葡萄酒中含量最高的花色苷，同样具有调节肠道菌群的作用，它或许是葡萄酒花色苷可以调节肠道菌群结构的主要原因。

葡萄酒花色苷和二甲花翠素-3--葡萄糖苷对肠道菌群的影响均具有浓度效应，浓度越高，对肠道菌群的影响时间越长，效果越明显。因此，葡萄酒花色苷或可通过调节肠道菌群的结构和组成部分发挥抑制肥胖和高血脂、改善糖尿病和调节肠道炎症等生理活性功能。