3种乳制品对低免疫力模型斑马鱼免疫功能的影响

史 珅，李昊虬，王 龙，李 楠，谭圣杰，刘 华，彭桂英，李亚兰，张 冲，FENG HAOTIAN,*

（1.内蒙古乳业技术研究院有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110；3.北京中医药大学生命科学学院，北京 100029）

饮奶在我国历史悠久，是国人日常膳食的重要组成部分。《2021中国奶商指数报告》显示，中国坚持每天摄入乳制品的人群规模约为3.6亿 人，仍有超过10亿 人尚未形成喝奶的习惯，但是国家卫生健康委于2020年发布的《新型冠状病毒感染的肺炎防治营养膳食指导》提出，科学合理的营养膳食能有效改善营养状况、增强抵抗力，有助于新型冠状病毒感染的肺炎防控与救治，倡导国人尽量保证每天“300 g奶及奶制品”以及“吃各种各样的奶及其制品”，可见乳及乳制品对维持国民健康的重要意义。王磊等的研究表明乳蛋白包括酪蛋白和乳清蛋白，其中牛乳中的乳清蛋白包括-乳球蛋白、-乳白蛋白、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）、乳铁蛋白等生物活性蛋白质，不仅均衡了氨基酸的组成结构、易于吸收，还具有抑菌、缓解机体炎症、改善肠道健康、增强机体免疫力等多种生理功效。此外，牛乳中低聚糖、溶菌酶、细胞因子等免疫活性物质可以直接或间接激活免疫系统，在改善睡眠、预防过敏和哮喘、预防和改善骨质疏松等方面发挥重要作用。乳制品是以奶为基本原料，利用加热、发酵、干燥或混合其他物质等方式制成的液态或固态食品，包括超高温灭菌乳、发酵乳、冰淇淋、奶粉、奶酪等形式。现代研究表明，乳制品能够提供人体必需的VB、VA、钙等营养素，且其营养素的吸收利用率高于其他食品，有助于提高人体免疫力。除此之外，不同的加工工艺和贮存条件能够影响牛乳及乳制品中营养成分的吸收，但是对其发挥免疫功效的影响尚不清楚。

斑马鱼是一种新型的模式生物，具有个体小、繁殖快、与人类基因同源性高等优点。斑马鱼的免疫系统分为天然免疫和获得性免疫系统，其天然免疫系统相关基因组与人类具有高度保守性，包括免疫细胞、免疫分子以及免疫应答方式。近年来，利用荧光标记的转基因品系斑马鱼模型来评价产品增强免疫功能的研究报道屡见不鲜，斑马鱼已然成为研究天然免疫系统的常用动物模型。因此，本研究采用静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液建立斑马鱼免疫功能损伤模型，通过分析巨噬细胞数量、巨噬细胞吞噬功能和T淋巴细胞数量，探讨3种常见加工方式乳制品（低温酸奶、常温纯牛奶和冷冻酸奶冰淇淋）对实验动物免疫功能的影响，以期为消费者提供更加营养美味的乳制品。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

本研究选取了3种品系的斑马鱼开展实验，分别为转基因巨噬细胞荧光斑马鱼（品系代号：Tg（coro1a:EGFP）hkz04tTg/+）、野生型AB品系斑马鱼、转基因T淋巴细胞荧光斑马鱼（品系代号：Tg（rag2:DsRed）zf411Tg），均由杭州环特生物科技股份有限公司提供。斑马鱼养殖以自然成对交配繁殖方式，按照实验需要选取同品系斑马鱼雌雄比例1∶2放置于产卵缸，每次交配准备4～5 对成年斑马鱼，采用隔板将雌雄斑马鱼隔开，次日光照前抽离隔板，使其自由受精，从抽离隔板开始计时，至抽离隔板2 h后收集受精卵，平均每对能产200～300 枚胚胎。在受精后6 h和24 h对死亡胚胎进行清理移除，并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎。饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～550 µS/cm；pH值为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO），饲养符合实验动物管理与评估协会要求（动物实验管理小组许可证号：001458）。实验动物使用许可证号为SYXK（2012-0171）。

全脂灭菌纯牛奶（常温纯牛奶），执行标准GB 25190ü2010《食品安全国家标准 灭菌乳》，由内蒙古伊利实业集团股份有限公司生产；活菌冰淇淋（冷冻酸奶冰淇淋），执行标准9.Q/NYLC 0014S《冷冻酸奶冰淇淋》，由内蒙古伊利实业集团股份有限公司生产；全脂发酵酸奶（低温酸奶），执行标准GB 19302ü2010《食品安全国家标准 发酵乳》，为市售某品牌杯装增强免疫力功能保健食品酸奶，作为功能对照使用。

酒石酸长春瑞滨注射液（以下简称“长春瑞滨”）杭州民生药业有限公司；过碳酸钠 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；荧光微球 中国Sigma-Aldrich公司。

斑马鱼培养水（养鱼用水）为实验室自制。

1.2 仪器与设备

斑马鱼养殖饲养系统 北京爱生科技有限公司；SZX7解剖显微镜 日本OLYMPUS公司；CCD相机上海土森视觉科技有限公司；AZ100电动聚焦连续变倍荧光显微镜 日本Nikon公司；CP214精密电子天平美国OHAUS公司；IM300显微注射仪、PC-10拉针仪日本Narishige公司。

1.3 方法

1.3.1 乳制品的生产工艺流程

常温纯牛奶：收奶→过滤→冷却贮存→（脱气→均质→）预杀菌→（脱气→均质→）超高温灭菌→冷却灌装→包装→出厂。

冷冻酸奶冰淇淋：首先制作酸奶基料和雪糕基料，酸奶基料：奶粉水合→混料→循环→定容→预热→脱气→均质→杀菌→降温→接种→发酵；雪糕基料：混料→循环→定容→预热→脱气→均质→杀菌→降温→接种。然后将酸奶基料和雪糕基料混合、乳化、降温后得到冷冻酸奶冰淇淋成品，包装后出厂。

1.3.2 营养成分分析方法

蛋白质量分数按照GB 5009.5ü2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》规定的方法测定；脂肪含量按照GB 5009.6ü2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》规定的方法测定；碳水化合物含量按照GB/Z 21922ü2008《食品营养成分基本术语》规定的方法测定；钙含量按照GB 5009.92ü2016《食品安全国家标准 食品中钙的测定》规定的方法测定；活性乳酸菌数量按照GB 4789.35ü2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》规定的方法测定。营养素参考值（nutrient reference values，NRV）是食品营养标签上比较食品营养成分含量的参考标准，是消费者选择食品时的一种营养参照尺度，NRV计算如公式（1）所示。

式中：为100 g食物中某营养素质量/g，RNI为食物营养素推荐摄入量（recommended nutrient intake）/g。

1.3.3 免疫低下斑马鱼模型制备

将质量浓度为10 mg/mL酒石酸长春瑞滨注射液用新鲜的斑马鱼培养水配制成质量浓度为0.2 mg/mL的应用液备用。斑马鱼胚胎发育至受精后3 d自然脱膜后，挑选发育正常已开口摄食的斑马鱼，通过显微注射的方式静脉注射质量浓度为0.2 mg/mL长春瑞滨10 nL建立斑马鱼免疫低下模型，表现为巨噬细胞数量减少、巨噬细胞吞噬功能减弱和T淋巴细胞减少。

1.3.4 实验动物分组及给样方法

按照随机分组法将受精后3 d发育正常的斑马鱼随机分为正常对照组、模型对照组、低温酸奶组、常温纯牛奶组、冷冻酸奶冰淇淋组，每组30 尾，斑马鱼培养水体积为20 mL，每组均加入0.5 mg质量分数0.01%过碳酸钠增氧。根据保健食品人体日推荐剂量等效换算，低温酸奶组、常温纯牛奶组、冷冻酸奶冰淇淋组分别给予质量浓度为8 333 μg/mL低温酸奶、70.4 μg/mL常温牛奶、33 333 μg/mL冷冻酸奶冰淇淋各3 mL，分别相当于200 g低温酸奶人体每日推荐量、250 mL常温纯牛奶人体每日食用量和50 g冷冻酸奶冰淇淋人体每日食用量。将给样后的烧杯放入28 ℃恒温培养箱中，每间隔24 h换一次培养液。

1.3.5 对巨噬细胞数量减少的保护作用的测定

选用受精后3 d转基因巨噬细胞荧光斑马鱼为实验对象，乳制品连续处理4 d后，每组随机选取10 尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，利用图像处理软件NIDS-Element’s进行图像分析，统计斑马鱼泄殖孔至尾部静脉中巨噬细胞荧光强度总和（），以统计学分析结果分别评价不同乳制品对巨噬细胞数量减少的改善作用，计算如公式（2）所示。

1.3.6 对巨噬细胞吞噬功能的保护作用的测定

选用受精后3 d野生型AB品系斑马鱼为实验对象，将荧光微球作为异物，0.4 mg/mL长春瑞滨和荧光微球按体积比1∶1制成混合液静脉注射受精后3 d的斑马鱼，注射体积为10 nL/尾，建立免疫功能损伤模型同时以异物引发巨噬细胞吞噬行为。乳制品连续处理4 d后，每组随机选取10 尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，用Image J图像分析软件统计斑马鱼体内剩余荧光颗粒的数量（），以统计学分析结果分别评价不同乳制品对巨噬细胞吞噬功能的改善作用，计算如公式（3）所示。

1.3.7 对T淋巴细胞数量减少的保护作用的测定

选用受精后4 d转基因T淋巴细胞荧光斑马鱼为实验对象，乳制品连续处理1 d后，每组随机选取10 尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，利用图像处理软件NIDS-Element’s进行图像分析，统计斑马鱼T细胞荧光强度（），以统计学分析结果分别评价不同乳制品对T细胞数量减少的改善作用，计算如公式（4）所示。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，数据结果以平均值±标准差表示，组间比较采用独立检验，＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 3种奶制品营养成分和活性菌群成分分析

2.1.1 常温纯牛奶检测结果

常温纯牛奶的主要营养成分检测结果如表1所示。蛋白质量分数（3.32f0.03）%，NRV为5%，优于灭菌乳蛋白质国家标准GB 25190ü2010《食品安全国家标准 灭菌乳》基线（2.9%），即每包250 mL常温纯牛奶满足12.5%的蛋白质营养素推荐摄入量；脂肪含量为（3.98f0.08）g/100 g，NRV为6%，优于灭菌乳脂肪GB 25190ü2010基线（3.1%），即每包250 mL常温纯牛奶满足15%的脂肪营养素推荐摄入量；碳水化合物含量为（4.93f0.19）g/100 g，NRV为2%，即每包250 mL常温纯牛奶提供的碳水化合物的量约合推荐摄入量的5%；钙含量为（118.60f2.29）mg/100 g，NRV为13%，即每包250 mL常温牛奶满足32.5%的钙营养素推荐摄入量。

表1 常温纯牛奶的营养成分检测结果（n＝5）Table 1 Results of determination of nutritional components in normal temperature milk (n = 5)

2.1.2 冷冻酸奶冰淇淋检测结果

冷冻酸奶冰淇淋的营养成分和活性菌群检测结果如表2所示。蛋白质量分数（3.25f0.02）%，NRV为5%，即每份50 g冷冻酸奶冰淇淋满足2.5%的蛋白质营养素推荐摄入量；脂肪含量为（8.78f0.17）g/100 g，NRV为10%，即每份50 g冷冻酸奶冰淇淋满足5%的脂肪营养素推荐摄入量；碳水化合物含量为（25.14f0.37）g/100 g，NRV为10%，即每份50 g冷冻酸奶冰淇淋提供的碳水化合物的量约合推荐摄入量的5%。对产品中4种不同活性乳酸菌（副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌）的总活菌数在货架期内进行了两次检测，第1个月检测乳酸菌数量为3.0h10CFU/g，18个月后活性乳酸菌数量为2.0h10CFU/g，达到GB 19302ü2010《食品安全国家标准 发酵乳》中≥1h10CFU/g的标准20 倍以上。

表2 冷冻酸奶冰淇淋的营养成分检测结果（n＝5）Table 2 Results of determination of nutritional components in frozen yogurt (n = 5)

2.2 3种奶制品对低免疫力斑马鱼巨噬细胞数量减少的保护作用

由图1可知，与正常对照组比较，模型对照组巨噬细胞数量高度显著降低（＜0.001），说明免疫功能损伤的巨噬细胞数量减少模型建立成功。与模型对照组比较，低温酸奶、常温纯牛奶和冷冻酸奶冰淇淋对斑马鱼巨噬细胞数量减少均表现出显著的保护作用，3种乳制品对斑马鱼巨噬细胞数量减少的保护作用分别达到47%（＜0.001）、85%（＜0.001）和32%（＜0.05）。常温纯牛奶组的巨噬细胞数量恢复到正常组水平（＞0.05），并显著优于低温酸奶组（＜0.05）。冷冻酸奶冰淇淋组的巨噬细胞数量与低温酸奶组比较无显著性差异（＞0.05）。

图1 不同乳制品对低免疫力斑马鱼巨噬细胞数量减少的改善作用Fig.1 Ameliorative effects of different dairy products on macrophage reduction in zebrafish

2.3 3种奶制品对低免疫力斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的保护作用

由图2可知，与正常对照组比较，模型对照组斑马鱼体内残留荧光颗粒的数量高度显著降低（＜0.001），表明免疫功能损伤的巨噬细胞吞噬功能减弱模型建立。与模型对照组比较，常温纯牛奶和冷冻酸奶冰淇淋对低免疫力斑马鱼的巨噬细胞吞噬功能有显著改善，这两种乳制品对低免疫力斑马鱼的巨噬细胞吞噬功能的改善作用分别为66%（＜0.05）和70%（＜0.05）。低温酸奶对斑马鱼巨噬细胞吞噬作用有改善趋势，但与低免疫力模型对照组比较未见显著差异（＞0.05）。

图2 不同乳制品对低免疫力斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的改善作用Fig.2 Promoting effect of different dairy products on macrophage phagocytosis in zebrafish

2.4 3种奶制品对低免疫力斑马鱼T淋巴细胞数量减少的保护作用

由图3可知，与正常对照组比较，模型对照组T细胞数量高度显著降低（＜0.001），表明免疫功能损伤的T细胞数量减少模型成功建立。与模型对照组比较，低温酸奶、常温纯牛奶和冷冻酸奶冰淇淋对低免疫力斑马鱼的T淋巴细胞数量减少均显示出显著保护作用，并恢复到与正常对照组无显著差异水平（＞0.05），这3种乳制品对低免疫力斑马鱼的T细胞数量减少的改善作用分别为89%（＜0.01）、127%（＜0.01）和140%（＜0.001）。

图3 不同乳制品对低免疫力斑马鱼T细胞数量减少的改善作用Fig.3 Ameliorative effects of different dairy products on T cell reduction in zebrafish

3 讨 论

长春瑞滨是一种半合成的长春花生物碱，具有广谱抗肿瘤活性，且毒性低，能够通过干扰细胞有丝分裂期微管的聚集而产生细胞毒性作用。研究表明，大剂量长春瑞滨骨髓抑制明显，导致血小板、红细胞和白细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞等）数目减少，最终诱导免疫力低下。巨噬细胞为人体天然免疫系统中的重要组成部分，具有强大的识别、吞噬、清除病原体及细胞组织残体的功能。作为免疫应答的第一道防线，可通过识别清除病原体、杀伤靶细胞、抗原提呈、免疫调节等功能维持机体的免疫稳态。T细胞可特异性地与靶细胞结合并直接杀死靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，也可通过释放细胞因子强化免疫效应。斑马鱼的免疫系统与人类具有高度相似性，在受精后的18 h左右，前体巨噬细胞在中胚层被最早发现，并迁移至卵黄囊，受精后24 h在造血区前段分化成巨噬细胞，然后通过血液循环散布在全身。斑马鱼的前体T细胞最早在肾脏骨髓里被发现，不断迁移至胸腺并在此分化，成熟后分布于各大组织。本研究中，静脉注射长春瑞滨处理导致转基因巨噬细胞荧光斑马鱼的巨噬细胞荧光强度减弱，巨噬细胞吞噬红色荧光微球异物的速率降低，以及转基因T淋巴细胞荧光斑马鱼的T淋巴细胞荧光强度减弱，从而直接指征斑马鱼免疫功能受损。而给予常温纯牛奶、低温酸奶和冷冻酸奶冰淇淋后，巨噬细胞和T淋巴细胞数目的增加以及巨噬细胞吞噬能力的增强，表明其增强了低免疫力斑马鱼的免疫功能。

低温酸奶中含有丰富的活性乳酸菌，研究表明，乳酸菌对全身免疫系统的调控大多通过参与调节适应性免疫中的体液免疫和细胞免疫进行的，也有部分通过参与调控天然免疫中的固有免疫屏障、固有免疫分子和固有免疫细胞来进行的。在细胞免疫中，乳酸菌可以提高巨噬细胞和单核细胞的活性，同时在不同的免疫微环境下可以促进巨噬细胞分化为不同的表型，在调节T淋巴细胞方面，研究发现乳酸菌能够促进辅助性T细胞分泌白细胞介素（interleukin，IL）-2，并且在均衡新生儿辅助性T细胞（T helper cell，Th）1和Th2方面起到重要作用。本实验结果显示低温酸奶具有增强免疫力的功效，显著提高低免疫力斑马鱼的巨噬细胞（＜0.001）和T淋巴细胞数量（＜0.01）。与该保健食品酸奶可增强免疫力功能的宣称一致，同时显示本研究中的实验方法具有一定的稳定性和可靠性，也给其他乳制品的免疫功能评估提供参考。

本研究中的常温牛奶样品含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物和钙，可能与其免疫功能有一定的必然联系。牛乳中含有免疫球蛋白、乳铁蛋白等优质蛋白质，免疫球蛋白（IgG、IgA和IgM等）作为一种维持机体免疫力的重要蛋白，可与过敏原、病原微生物以及细菌结合，中和毒素，使其丧失感染侵袭宿主细胞的能力，并介导补体活化、免疫调节等免疫反应，在增强机体免疫能力、防止细菌和病毒入侵、活化补体等方面发挥重要作用；乳铁蛋白可以抑制并杀伤病原微生物，还可与病原体的表面蛋白结合，发挥抗病毒作用，阻止病毒入侵。此外，牛乳中还含有大量酶和生物活性肽，大都具有抗菌以及抗病毒的活性，在体内起到免疫调节的作用。牛奶中通常含有3%～5%的脂质，其中包括甘油酯、类脂和游离脂肪酸等，约有98%以上的脂肪酸是以结合态甘油酯或类脂形态存在，较少部分则是以游离脂肪酸的形式存在，牛奶中的脂质成分被乳脂球膜包裹，以乳脂球的形式稳定分散。并且，牛奶中富含多不饱和脂肪酸，如共轭亚油酸、-3多不饱和脂肪酸在心血管疾病和癌症的预防中发挥重要作用，中短链脂肪酸对肠道健康有益，支链脂肪酸又具有抗炎作用。牛奶中的另一个主要营养成分是碳水化合物，其中除了代表性的乳糖，还有一些活性多糖和低聚糖的存在，有研究发现牛乳中含有和人乳中类似的可参与免疫反应的低聚糖，参与机体免疫系统的营养支持和活化。钙与人体的免疫力存在密不可分的关系，机体低钙情况下，可能通过降低弗林蛋白酶（Furin）mRNA的表达，导致特定人群的血清补体C3水平降低，从而使免疫力降低，增加上呼吸道感染的危险。钙网蛋白（calreticulin，CRT）是46 kDa大小的Ca结合内质网常驻蛋白，通过调节细胞内钙浓度、增强抗原递呈、清除凋亡细胞、影响小鼠的Th1/Th2平衡、参与肿瘤免疫应答、佐剂效应等方式，实现免疫调节功能。牛奶中含有乳矿物盐形式的乳钙，可以为机体免疫系统提供钙源，从而维持并增强正常免疫功能。本实验研究结果显示常温纯牛奶含有蛋白质、脂肪、碳水化合物和钙等营养素，并具有增强免疫力的功能，表现为能显著增加低免疫力斑马鱼的巨噬细胞数量和T细胞数量，能显著改善巨噬细胞的吞噬功能，并能够使巨噬细胞数量和T细胞数量恢复到正常水平，且常温纯牛奶对低免疫力斑马鱼巨噬细胞数量的增加效果优于实验中作为参照的“增强免疫力”功能保健食品低温酸奶样品。

冷冻酸奶冰淇淋是以酸奶为主要原料之一的乳制品，除了具有牛奶丰富的营养成分以外，还包含副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌4种优势菌种，并且其冷冻贮藏条件较普通冷藏条件更有利于保持酸奶的性状、营养成分和菌种活性。副干酪乳杆菌具有抑菌和增强免疫力的功效，可显著提高腹泻小鼠单核巨噬细胞的吞噬能力，通过提高转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平，同时降低IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-17和IL-23等炎症因子水平，以及调节肠道菌群来维持人体消化系统的免疫稳态。保加利亚乳杆菌具有免疫激活和免疫调节的作用，主要通过提高免疫细胞的活性起到提高免疫力的功效，并能提升单核细胞活性和吞噬作用，诱导其产生多种细胞因子。研究还发现保加利亚乳杆菌的胞外多糖具有通过调节免疫力发挥对人体肿瘤细胞的显著抑制作用。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合发酵产物对小鼠迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity，DTH）、免疫脏器指数、血清溶血素等细胞免疫和体液免疫特征指标均有提升作用，发挥协同增效作用。嗜热链球菌可有效提高血清中IgG、IgM的含量，改善脾淋巴细胞增殖，提升巨噬细胞的吞噬功能，提高自然杀伤细胞杀伤活性。嗜酸乳杆菌可以在肠道定殖，激活巨噬细胞，诱发特异性免疫和非特异性免疫，提高淋巴细胞增殖活性。嗜酸乳杆菌胞外多糖可以提高小鼠迟发性变态反应，促进溶血空斑形成，并且通过胞壁肽聚糖影响肠道上皮细胞病理形态，促进小肠黏膜分泌分泌性免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA），降低干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）及TNF-α的表达，增强小鼠巨噬细胞吞噬活性，促进小肠黏膜的发挥免疫调控作用。本研究中，含有上述4种菌株的冷冻酸奶冰淇淋能显著提高低免疫力斑马鱼的巨噬细胞数量和T细胞数量，并具有改善巨噬细胞吞噬功能的作用，与各菌株的相关研究结果一致。

活性益生菌对肠道微生态的平衡和改善，以及对机体免疫力的调节作用已成为近年来的研究热点，甚至对于过敏性鼻炎、自身免疫性疾病和低免疫力机体的保护作用也多见报道。冰淇淋作为一种常见休闲食品不仅具有独特的口感和性状，更重要的是其冷冻低温的加工和贮藏方式保障了乳制品中益生菌的活性及胃肠利用率，在未来益生菌类功能食品的应用开发中值得关注。以上结果显示，3 款乳制品均能增强免疫功能，为乳制品的免疫功能方向研究和应用提供了理论基础，但进一步的作用机制和应用特性仍需深入研究。