手十二井穴放血激活TRPV1通道保护心脏骤停后综合征大鼠中枢神经损伤

钟晓芃,郭 义

(1.天津市人民医院，天津 300122；2.天津中医药大学，天津 301617)

心脏骤停后综合征(Post-cardiac arrest syndrome,PCAS)是心脏骤停后，机体在非自然状态下(人工心肺复苏)自主循环恢复(ROSC)后出现的一种特殊病理生理状态[1]。在我国，每年约有54.4万人发生心搏骤停，仅有1.4 %的患者在心肺复苏成功后脑功能完全恢复[2]。根据2018美国心脏协会(AHA)公布的心肺脑复苏(CPCR)与心血管急救(ECC)指南[3]，呼吸心跳停止患者复苏的成功标志已不再是单纯的心肺功能恢复，而是脑的存活与功能恢复，因此心肺复苏成败的关键在于脑复苏。

亚低温是目前被临床实践大量证实能改善心搏骤停患者存活率、神经功能预后的临床治疗措施[3]。但亚低温操作复杂，易引起寒战、免疫抑制和感染等并发症并限制了亚低温的应用和推广[4]。那么临床上是否能够找到一种应用简便、安全的治疗方法是当务之急。

在中国古代，将十二井穴刺络放血用做各种紧急情况中的急救措施，已有3 000多年的历史了。目前大量研究证明了井穴放血对中枢神经损伤具有保护作用，井穴放血治疗卒中[5]、颅脑外伤[6]和CO中毒[6]这些疾病可以减少脑损伤和神经功能障碍。井穴放血可降低大鼠脑缺血后脑组织NO含量及NOS活性，保护脑组织免受自由基的损伤[7-8]；可明显上调缺血区皮层脑组织HSP70的表达水平，增强脑修复能力[9]；可通过快速提高缺血区c-fos蛋白的含量改善神经细胞的应激能力[10]。然而井穴放血对于心脏骤停后综合征脑损伤的保护作用及其机制未见报道。

TRPV1是存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的一类与多种感受功能有关的非选择性阳离子通道蛋白，在中枢神经系统有广泛的表达，在神经系统中具有重要的功能[6]。本课题组前期研究显示二氢辣椒素可以通过激活TRPV1通道减少凋亡因子的表达，在一定程度上抑制神经细胞的凋亡，发挥神经保护作用[11]。早期的研究证实十二井穴刺络的治疗作用与放血、疼痛刺激和腧穴3个因素密切相关[12]，笔者推测辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1)作为在神经末梢及中枢神经广泛分布的伤害性刺激感受器，可能在十二井穴刺络放血治疗中起到重要作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠年龄49～60 d，体质量222～373 g，购自北京维通利华实验动物有限公司许可证号SCXK(京)2016-0006，饲养于天津易生源生物科技有限公司动物实验室。本实验经天津市人民医院实验动物伦理委员会审批同意。

1.2 试剂与仪器

辣椒平(厂家：阿拉丁，货号：C126558-10mg lot#A1908148);肾上腺素(厂家：天津金耀药业有限公司国药准字H12020526规格：1 mL∶1 mg);SIEMENS Siredoc220多功能生理监测仪(Siemens，Inc.，Berlin，Germany);普朗DNM-9602酶标仪;Rabbit Anti-TRPV1(公司：武汉博士德,货号：44556B12J10);Anti-Caspase-3(公司：abcam,货号：Ab4051);Bcl-2 Antibody(武汉艾美捷科技有限公司,货号：3195-100);Rat S100A1 Calcium Binding protein(S100A1)(公司：武汉艾美捷科技有限公司,货号EK16495);β-Actin(公司：SAB,货号：21338);Goat Anti-Rabbit IgG(公司：武汉博士德，货号SAB1494);原位细胞凋亡检测试剂盒(美国ROCHE公司);光学显微镜(日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11)。

1.3 十二井穴放血

在心肺复苏的模型建立1 h后，将一个21型号规格的采血针(中国江苏省苏州施泰瑞医疗设备有限公司)垂直插入皮肤，两侧取穴的末端深度为1 mm，以少商、商阳、中冲、关冲、少冲和少泽的顺序。参考人体解剖学穴位，将比较解剖学用于穴位选择[13]。为了使每个穴位出血15～20 μL，分别将其挤压3～5次，然后用棉球压缩。在24 h、48 h分别进行放血操作。假手术组和模型组的大鼠以相同的强度抓握，而穴位不刺血。

1.4 造模方法

SD大鼠术前禁食但不禁水，戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔内麻醉，备皮，仰卧位固定。经口直视插入14号气管鞘管。左股动脉置入23号PE-50聚乙烯管，并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理监测仪(Siemens，Inc.，Berlin，Germany)监测动脉血压、心电图和直肠温度。手术完成后，待大鼠生理参数稳定开始夹闭气管插管，观察大鼠呼吸、心搏和血压，心搏停止以动脉收缩压<20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)作为心脏骤停标准。心搏骤停后开始进行心肺复苏频率为200次/min的胸外按压和100次/min的同步机械通气，按压深度为胸廓前后径的1/3，吸入氧浓度100%。按压2 min后，予肾上腺素0.025 mg/kg静脉注射，持续按压通气10 min，期间如出现室颤，立即给予2 J的双向波除颤，如自主循环恢复(Restoration of sponta-neous circulation，ROSC)则停止按压，10 min未恢复自主循环宣布复苏失败。ROSC定义为恢复室上性心律，平均动脉压(MAP)>60 mmHg，维持5 min以上。复苏成功的动物连续监测血流动力学1 h，术毕拔除所有插管，苏醒后放回笼中饲养，使用自制保温设备使动物肛温保持在36.5 ℃左右。

1.5 分组

24只健康雄性Sprague Dawley大鼠(体质量222～373 g;年龄49～60 d)由中国科学院放射学研究所动物中心提供。随机分配到4组。

1.5.1 假手术组(Control组，6只) 只行气管插管，不诱导心脏骤停和进行心肺复苏(CPR)。

1.5.2 模型组(Model组，6只) 气管夹闭窒息法诱导心脏骤停后进行常规CPR。

1.5.3 手十二井穴放血组(HTWP组，6只) 气管夹闭窒息法诱导心脏骤停后进行常规CPR，复苏后1 h、24 h和48 h分别进行手十二井穴放血。

1.5.4 辣椒平组(CPZ组，6只) CPZ组大鼠于气管夹闭窒息法诱导心脏骤停前45 min经腹腔注射辣椒平20 mg/kg。心脏骤停后进行常规CPR，复苏后1 h、24 h和48 h分别进行手十二井穴放血。

72 h后按伦理学要求处死动物，取大脑海马组织。-80 ℃冻存,用于分子生物学研究。

1.6 观测指标

1.6.1 纸带移除实验 评估复苏后大鼠的感觉运动功能,在行复苏术的前3 d开始对大鼠进行适应性训练，并由专人负责测试并记录时间[14]。在复苏后72 h处死前进行正式测试、计时，取3次测试结果的均数作为测试成绩。设定180 s为观察终点，达到或超过180 s者均计为180 s。

1.6.2 神经缺陷分数(NDS) 神经功能通过确定神经缺陷分数，在动物在复苏后72 h被处死之前进行评估。神经缺陷评分(NDS)[15]，范围从0～80(80表示正常大脑功能)，是基于唤醒神经系统反射，运动功能和简单行为反射的测试。每组大鼠由两名助手独立评分，取平均值，获得最终的神经缺陷分数。

1.6.3 尼氏染色 将5 μm石蜡切片常规脱蜡至水。用移液器在组织上滴加适量Nissl染液,染色8 min,然后用ddH2O洗涤2次,30 s/次。再将切片进行脱水、透明,分别于95%乙醇I、95%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2、2、5、5 min,最后滴加中性树胶、用盖玻片封片。待自然风干后在光学显微镜观察拍照。

1.6.4 TUNEL法检测大鼠海马CA1区神经细胞凋亡 复苏成功后72 h断头处死大鼠,取海马组织CA1区，在4 %甲醛溶液固定24 h后，常规石蜡包埋，4 μm切片，按照过氧化物酶标记的原位细胞凋亡检测试剂盒(罗氏)说明书行TUNEL检测。每组大鼠取5张切片，100倍显微镜(Olympus,CX41)下观察大脑皮层神经元的形态，胞核成深棕色的细胞即为凋亡细胞。

1.6.5 Western blot检测大鼠海马CAl区TRPV1、Caspase3及Blc-2表达 复苏成功后72 h断头处死大鼠，取大鼠CA1区脑组织，冰浴匀浆，4 ℃离心(12 000 r·min-1，30 min)两次，取上清。进行蛋白定量后，电泳、转膜和封闭，加兔抗大鼠TRPV1、Caspase3及Blc-2单克隆抗体(1∶1 000)，二抗为羊抗兔IgG，ECL化学发光法显色，凝胶成像图像分析系统分析。对照选用抗β肌动蛋白抗体(β-actin)。目的蛋白与相应β-actin蛋白的灰度比值作为该目的蛋白的相对表达量。

1.6.6 血清S100β水平检测 麻醉后摘眼球取血3～6 mL,室温血液自然凝固,3 000 r/min离心10 min,取上清液,-20 ℃冷藏。采用ELISA法检测血清S100β水平。严格按照试剂盒说明书操作步骤进行操作,最后用普朗DNM-9602酶标仪进行检测,以空白孔调零450 nm波长测每孔OD值。

1.7 统计学处理

采用SPSS11统计软件对结果进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多样本均数两两比较采用SNK-q检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组纸带移除实验比较

Control组用时少于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05),HTWP组用时少于Model组及CPZ组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠纸带移除实验、神经缺陷评分

2.2 各组神经缺陷分数(NDS)比较

Control组评分多于其他3组，差别有统计学意义(P<0.05),HTWP组评分多于Model组及CPZ组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3 各组尼氏染色比较

甲苯胺蓝染色显示,Control组大鼠海马神经元细胞、胞质内可见深蓝色斑块状或虎斑样尼氏体,细胞核大,核仁明显,无胶质细胞增生和胶质瘢痕形成;Model组与CPZ组大鼠海马神经元细胞胞质内尼氏小体固缩坏死,溶解、液化后形成空泡样结构;与模型组CPZ组比较,HTWP组大鼠脑组织神经元水肿较轻,神经元形态较好,仅见少量空泡样改变,有部分神经元细胞核肿大,核仁消失。见图1。

2.4 各组大鼠海马神经细胞凋亡情况比较

Control组大鼠TUNEL阳性细胞较少。心脏骤停后综合征使大鼠海马神经元发生凋亡，而HTWP组细胞凋亡计数较Model组、CPZ组更少,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2和表2。

表2 各组大鼠凋亡细胞计数

2.5 各组海马CA1区TRPV1、Caspase3及Blc-2表达比较

HTWP组的TRPV1和Blc-2表达明显高于其他3组,差异有统计学意义(P<0.01)。Control组与HTWP组的Caspase-3表达相似，差异无统计学意义(P>0.05)。HTWP组的Caspase-3表达明显低于Model组和CPZ组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表3。

表3 大鼠海马神经细胞Caspase-3、TRPV1及Bcl-2蛋白表达

2.6 各组血清S100β水平比较

Control组虽然低于HTWP组,但差异无统计学意义(P=0.2195)。HTWP组的血清S100β水平低于Model组和CPZ组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清S100β水平

3 讨论

十二井穴刺络放血用于急救在我国有着悠久的历史，其简捷、高效、长于院外急救、自救及他救，弥补了现代医学的不足。心脏骤停在中医学属于“厥证”范畴，基本病机为气血阴阳不相顺接、阴阳离决。经心肺复苏呼吸循环恢复后，患者气血阴阳初复，气血运行无力，易出现瘀血痰浊上蒙清窍，故仍昏迷不醒。此时应用手十二井穴刺络放血可续接阴阳、活血祛瘀和化痰开窍促进病人苏醒。《灵枢·九针十二原》篇曰:“病在脏者，取之井”。明代朱权所撰《乾坤生意》云：“凡中风跌倒，卒暴昏沉、痰涎壅滞、不省人事、牙关紧闭和药水不下，急以三棱针，刺手十指十二井穴，当去恶血，治一切暴死恶侯，不省人事，及绞肠痧，乃起死回生妙诀”，《医宗金鉴·刺灸心法要诀》中指出：“商阳主刺卒中风，暴仆昏沉痰涎壅，少商、中冲、关冲、少泽、商阳，使气血流行，乃起死回生救急之妙穴”。

本研究笔者发现：在复苏后综合征发生的72 h内，手十二井穴放血可以减少心脏骤停动物模型海马神经凋亡，促进神经功能恢复，但这种作用会被TRPV1受体特异性阻断剂辣椒平所拮抗。

心搏骤停复苏后幸存的患者往往遗留程度不等的神经功能缺陷。准确判断神经功能损伤程度，对于病情观察及治疗效果的判断有很大帮助。目前，对复苏后大鼠神经功能缺损的评价多采用NDS量表进行[15]。而纸带移除实验则是操作简单且能比较精确评价大鼠感觉运动综合能力的指标[14]。本研究可知：不论是NDS评分还是纸带移除实验，十二井穴放血组大鼠神经功能的恢复程度明显好于模型组。

尼氏体是神经元的特征性结构之一,其大小及数量多少能反映神经细胞合成蛋白质功能的程度[16],当尼氏体染色变淡,甚至溶解消失时,说明神经元细胞正在遭受损伤，本实验可知十二井穴放血具有较好的神经细胞保护作用。

心脏骤停后综合征是由缺血再灌注损伤引起的全身多组织器官的多器官功能障碍，患者的预后取决于神经功能障碍恢复的程度[17]。脑缺血再灌注后会启动一系列的生理改变，包括氧自由基增多、钙超载、炎性因子释放、BCL-2表达减少和Caspase-3等过表达，这些可引起神经细胞凋亡[18-19]。本实验中模型组海马神经A1区细胞出现大量凋亡，十二井穴放血组可减少神经细胞凋亡，但这种作用会被TRPV1受体拮抗剂辣椒平阻断。

S100蛋白在中枢神经系统中的含量比其他组织多，是神经系统的特异性蛋白，它作为脑神经胶质细胞完整性的特异标志物被广泛研究。S100β蛋白可作为中枢神经系统损伤的早期标志物[20]。本研究显示十二井穴放血组血清S100β蛋白含量低于模型组和DHC组，反应了井穴放血对中枢神经细胞损伤的保护作用。

众所周知Bcl-2和Caspase-3是参与调节细胞凋亡的两个重要蛋白。Bcl-2能够维持和保护线粒体膜的稳定性，因此被称为膜稳定蛋白，并且可以抑制自由基产生、维持细胞核内钙离子浓度和抑制caspase-3激活等，可抑制细胞凋亡早期阶段[21-22]。Sueur S等[23]研究发现Bcl-2在心肌氧化应激损伤模型中可以特异性地抑制心肌细胞凋亡，升高胞内Blc-2含量,可以降低心肌细胞的缺血再灌注损伤。与模型组相比井穴放血组Bcl-2表达升高、Caspase-3表达降低和凋亡细胞减少。

TRPV1是配体门控的非选择性阳离子通道，被认为是各种疼痛刺激(如内源性脂质，辣椒素，热和低pH)的重要整合剂。除了在周围神经中表达外，TRPV1还在中枢神经系统中表达。大量研究证实TRPV1对于缺血再灌注器官损伤具有保护作用,其机制涉及减少促凋亡因子的释放抑制凋亡、改善线粒体功能和修复血脑屏障等各个方面[11,24-26]。

本课题组早期的研究表明激活神经中枢TRPV1通道可以治疗大鼠心脏骤停综合征脑损伤[11]。最近有研究表明TRPV1是小鼠外周神经和中枢神经系统中针灸操作的响应通道[27]。本研究也表明手十二井穴放血组TRPV1在神马神经的表达高于模型组，而当使用TRPV1特异性阻滞剂辣椒平预处理后手十二井穴的神经保护作用减弱，与手十二井穴组相比其神经功能评分下降，Bcl-2蛋白表达减少，Caspase-3蛋白表达增加，海马凋亡细胞增多,进一步证明了TRPV1通道在井穴放血治疗中的特异性。

总之，本研究结果表明，手十二井穴的放血可有效减轻心脏骤停综合征大鼠海马神经细胞凋亡，TRPV1通道在其中起到了关键作用。其作用机制可能与上调Bcl-2蛋白、减少凋亡因子Caspase-3的表达和减少因缺血再灌注引起的神经细胞凋亡有关。手十二井穴放血应用简便，易于推广，疗效确切，今后手十二井穴放血在复苏后综合征患者的神经功能恢复的治疗中将起到重要作用。