基于UPLC-QTOF-MS/MS 的藏药翼首草不同提取物化学成分比较研究

黄美玲，周 静**，伍城颖，曾 真，李松林，钱士辉，3*

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028；2.江苏省中医药研究院 中药质量与代谢组研究室，江苏 南京 210028；3.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014）

翼首草，又名“榜姿多沃”，为藏医常用药材，来源于川续断科植物匙叶翼首草［Pterocephalus hookeri（C.B.Clarke）Hoeck］的干燥全草［1］。据《晶珠本草》记载，翼首草具有解毒、清新旧热、治瘟病时疫的功效，常用于治疗风湿性关节炎，肠绞痛等［2］。翼首草主要含有环烯醚萜苷类（马钱苷、獐牙菜苷、吴茱萸苷等）［3］，三萜类（熊果酸、齐墩果酮酸等）［4］，苯丙素类（绿原酸等）［5］等活性成分，具有抑菌［6］、抗炎镇痛［7］，抗类风湿性关节炎［8］，抗肿瘤［9］等作用。

中药传统给药方式多为水煎服，而现代制剂为不同溶剂提取［10］。研究已证实，不同提取溶剂对药材有效成分的溶出影响较大［11］。对翼首草而言，《中华本草》记载其为煎汤内服［12］，而现代中药制剂“复方抗感颗粒”中翼首草的最佳提取工艺为75%乙醇热回流［13］。另有研究表明，翼首草的水提取物具有更强的镇痛、抑菌作用，醇提取物则具有更显著抗炎作用［14］。有学者应用超高效液相色谱联用四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS/MS）对翼首草成分进行了鉴定［15］，但对翼首草水提取物和醇提取物的系统化学成分分析及比较研究尚未见报道。

UPLC-QTOF-MS/MS 由于其对分析物高效的分离能力，对信号快速灵敏的响应，被广泛用于中草药的定性及半定量评价［16-17］。本研究拟采用UPLCQTOF-MS/MS技术，通过对照品指认、文献比对以及质谱裂解规律解析，鉴定翼首草水提取物及75%乙醇提取物中的化学成分［18］，并进一步采用主成分分析法（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）辨识翼首草两种提取物的差异成分。对翼首草水提取物和醇提取物进行化学成分比较研究，为阐释不同提取工艺翼首草及其制剂功效的偏向性和质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters Acquity UPLCTM系统（美国Waters 公司，配有二元高压泵，自动进样器，柱温箱）；Waters Synapt G2-S QTOF 质谱仪（美国Waters 公司，配备电喷雾离子源以及MassLynx v4.1 质谱工作站）；Mettler百万分之一电子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2 试剂

新绿原酸（neochlorogenic acid，批号：19042305，成都普菲德生物技术有限公司）；奎宁酸（quinic acid，批号：190821，成都普菲德生物技术有限公司）；咖啡酸（caffeic acid，批号20110501，成都普菲德生物技术有限公司）；马钱苷酸（loganic acid，批号：19092601，成都普菲德生物技术有限公司）；马钱苷（loganin，批号：18032903，成都普菲德生物技术有限公司）；绿原酸（chlorogenic acid，批号：FY1435B426，南通飞宇生物科技有限公司）；隐绿原酸（cryptochlorogenic acid，批号：19042402，成都普菲德生物技术有限公司）；獐牙菜苦苷（swertiamarin，批号：18031201，成都普菲德生物技术有限公司）；獐牙菜苷（sweroside，批号：19090902，成都普菲德生物技术有限公司）；熊果酸（ursolic acid，批号：19122703，成都普菲德生物技术有限公司）；齐墩果酸（oleanolic acid，批号：18051406，成都普菲德生物技术有限公司）；齐墩果酮酸（oleanonic acid，批号：17072711，成都普菲德生物技术有限公司）；所有对照品纯度按HPLC 面积归一化法测定均≥95%。乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；甲醇为色谱纯（德国Merck 公司）；甲酸为质谱纯（美国Sigma-Aldrich公司）；双蒸水为自制（Milli-Q）；其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

翼首草药材购买自安徽亳州（JSPACM-78-2）、西藏拉萨（JSPACM-78-7）、四川阿坝（JSPACM-78-8）、青海玉树等地（JSPACM-78-9），经由江苏省中医药研究院李松林研究员鉴定为川续断科植物匙叶翼首草［Pterocephalus hookeri（C.B.Clarke）Hoeck］的干燥全草。样品标本存于南京中医药大学附属中西医结合医院中药质量研究室。

2 方法

2.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm）；流动相A 为水溶液（含0.1%甲酸），流动相B 为乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脱程序为：0～1 min，92%～92% A；1～4 min，92%～80%A；4～5 min，80%～70%A；5～8 min，70%～50%A；8～12 min，50%～5% A；12～14 min，5%～5% A；14～15 min，5%～92%A；15～17 min，92%～92%A；流速为0.4 mL/min；柱温35°C；进样体积为2 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源采用正负离子模式扫描，以氮气为雾化气和锥孔气，毛细管电压2.5 kV，锥孔气流速50 L/h，离子源温度100°C，去溶剂化温度450°C，去溶剂气流速800 L/h，扫描时间0.2 s在全扫描模式下进行定性分析，使用MSECentroid 的数据采集形式在分辨率模式下采集数据，扫描范围m/z100～2 000，锥孔电压为40 V，MSE碰撞能量设置为20～50 eV。以亮氨酸脑啡肽为校正液（［M-H］-m/z554.261 5）所得质谱数据由Waters 公司软件MassLynx V4.1收集获得。

2.3 供试品溶液的制备

翼首草水提取物：分别精密称定4 批次的翼首草药材10.0 g，置圆底烧瓶中，加水250 mL，置于电热套加热回流提取1.5 h，取上清，再加水250 mL 回流1 h，合并两次提取液，浓缩至50 mL。吸取少量于12000 r/min 离心10 min 后，取上清液，再12000 r/min 离心10 min，即得水提供试品溶液，平行条件下提取两份，质谱分析前用质谱甲醇稀释至含生药80 μg/mL。

翼首草75%乙醇提取物：分别精密称定4 批次的翼首草药材10.0 g，置圆底烧瓶中，加75%乙醇250 mL，置于电热套加热回流提取1.5 h，取上清，再加75%乙醇250 mL 回流1 h，合并两次提取液，浓缩至50 mL。吸取少量于12000 r/min 离心10 min，取上清液，再12 000 r/min 离心10 min，即得醇提供试品溶液，平行条件下提取两份，质谱分析前用质谱甲醇稀释至含生药80 μg/mL。

2.4 对照品溶液的制备

精密称取12 个对照品适量，用甲醇配制约为1 mg/mL 的对照品储备液。吸取相同量的12 个对照品储备液混合，并加甲醇稀释为约1 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.5 数据库的建立与数据分析

通过检索CNKI，PubMed 等数据库，对翼首草的化学成分进行总结归纳，共检索到93 个化学成分［4，18-19］。利用ChemBioDraw 软件、PubChem、Chemicalbook 等平台收集化学成分的名称、分子式、结构式、相对分子质量等信息。首先建立翼首草化学成分数据库，根据低能量质谱所提供的精确相对分子质量、同位素丰度和同位素间距等信息与数据库中的化学成分进行匹配；并进一步利用高能量质谱数据，根据所得的碎片信息对各色谱峰进行鉴定。同时与对照品比对出峰时间、精确分子量和高能量碎片确认部分色谱峰。最终利用植物代谢组学策略，辨识翼首草不同提取物的差异化学成分。

3 结果与分析

3.1 翼首草水提取物与醇提取物的化学成分鉴定

翼首草化学成分在UPLC-QTOF-MS/MS 负离子模式下响应较正离子模式有更好的稳定性和更低的背景干扰，故本文均在负离子模式下解析化合物。翼首草混合对照品、水提取物与75%乙醇提取物的基峰离子流色谱图（Base peak ion chromatogram，BPI）见图1。从图中可以看出，水提取物与75%乙醇提取物的色谱图轮廓有明显差异。对各色谱峰进行鉴定，首先利用低能量质谱获得各色谱峰的精确分子量与对照品以及本课题组建立的翼首草数据库中的化学成分进行匹配，获得初步的鉴定结果，再利用高能量质谱数据进行验证。从4 批次翼首草水提取物及醇提取物中共鉴定出48 个化合物（表1），其中化合物1（quinic acid），14（luteolin 7-glucoside 或者kaempferol 5-glucoside 或者luteolin 7-galactoside），15（tectoridin 或者同分异构体），37（Oleanolic acid 3-Xyl-Rha-Xyl-Rha-Glc-Xyl），40（Oleanolic acid-Xyl（1→3）-Xyl（1→3）-Rha（1→3）-Rha（1→3）-Xyl）为在翼首草中首次发现。对翼首草中特征性化合物的质谱裂解规律进行了归纳以鉴定同类型化合物，分述如下。

图1 混合对照品（A），水提（B），75%醇提（C）翼首草样品在负离子模式下的BPI 图Fig.1 BPI chromatogram of reference compounds（A），WE（B）and 75%EE（C）of P.hookeri in negative ion mode

3.1.1 环烯醚萜类

环烯醚萜类化合物的裂解多以糖苷键断裂为主，质谱条件下容易脱去CO、CO2、H2O、OCH3等中性基团［20］。以对照品loganic acid（C16H24O10）为例，在负离子模式下其低能量准分子离子峰为［M-H］-m/z375.128 4。同时观察到碎片［2M+Na-2H］-m/z773.246 8 和两分子缔合碎片［2M-H］-m/z751.266 7；在高能量质谱中发现3 个碎片离子m/z213.075 9、169.087 3、151.075 0，由于loganic acid 的结构中存在-Glc、-COOH、-OH 基团，推测对应于［M-HGlc］-、［M-H-Glc-CO2］-、［M-H-Glc-CO2-H2O］-。翼首草提取物样品中化合物4 的保留时间、特征碎片等与其一致，确认为loganic acid。依此裂解规律结合文献共鉴定出18个环烯醚萜类化合物，为化合物2（8-epi-Loganin acid）、4（loganic acid）、6（loganic acid 同分异构体）、9（swertiamarin）、10（loganin）、11（sweroside）、12（6＇-O-β-apiofuranosylsweroside）、13（dipsanosides H）、17（8-epideoxyloganic acid）、20（sylvestroside I）、22（cantleyoside）、23（laciniatoside I）、24（dipsanosides B 或者dipsanosidesA）、25（Laciniatoside I 同分异构体）、27（pterocephaline）、28（sylvestroside III）、29（sylvestroside VI）、31（sylvestroside III di-methyl acetal）。其中化合物4、9、10、11 为对照品确认，化合物2、6、12、13、17、20、22、23、24、25、27、28为结合文献推测确定（详见表1）。

表1 基于UPLC-QTOF-MS/MS的翼首草化学表征Tab.1 UPLC-QTOF-MS/MS based chemical profiling of P.hookeri

续表

续表

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3.1.2 苯丙素类化合物

苯丙素类化合物是一类基本母核为C6-C3的化合物，在翼首草中主要为含有两分子结构的咖啡酰奎宁酸类化合物［5］。此次翼首草共鉴定得到9个苯丙素类化合物。苯丙素类化合物在质谱条件下以一分子奎宁酸结构的脱落和CO2等中性小分子的碎片脱落为主。 以对照品neochlorogenic acid（C16H18O9）为例，在负离子模式下易形成［M+Na-2H］-375.063 4，其低能量准分子离子峰为［M-H］-m/z353.086 6；在高能量质谱中出现两个碎片离子m/z179.033 4、m/z135.045 0，由于neochlorogenic acid 的结构中存在奎宁酸基，羧基推测对应于［MC7H10O6-H］-、［M-C7H10O6-CO2-H］-。翼首草提取物样品中化合物3的保留时间、特征碎片等与其一致，确认为neochlorogenic acid。依此裂解规律共鉴定出9 个苯丙素类化合物为化合物3（neochlorogenic acid）、5（chlorogenic acid）、7（cryptochlorogenic acid）、8（caffeic acid）、16（8-hydroxypinoresionl-4＇-Oβ-D-glucoside）、18（8＇-hydroxylpinoresionl-4＇-Oβ-D-glucoside）、19（3，4-dicaffeoylquinic acid）、21（3，5-dicaffeoylquinic acid）、26（4，5-dicaffeoylquinic acid）。其中化合物3、5、7、8 为对照品比对，16、18、19、21、26为结合文献推测确定（详见表1）。

3.1.3 黄酮类化合物

在翼首草中首次发现两个黄酮类化合物。黄酮类化合物在质谱条件下以一分子苯酚、CO 和H2O等中性小分子的碎片脱落为主。以化合物14 为例解析，在负离子模式下检测到［M-H］-m/z447.092 1、［M-C6H10O5-H］-m/z285.785 8根据元素分析结果确定其分子式为C21H20O11。根据碎片m/z257.042 2［M-C6H10O5-CO-H］-、m/z267.026 5［M-C6H10O5-H2O-H］-和发生RDA 裂解的特征碎片m/z151.006 5［M-C6H10O5-C8H8O2-H］-、m/z133.029 8［M-C13H13O9-H］-推测其为黄酮苷类化合物，进一步结合文献鉴定化合物14 为luteolin 7-glucoside 或者kaempferol 5-glucoside 或者luteolin 7-galactoside［21］；化合物15在负离子模式下准分子离子峰为［M-H］-（m/z461.105 8），推测分子式为C22H22O11。同时根据碎片m/z299.051 2、m/z281.045 7、m/z205.011 7 推测其分别对应于［M-C6H10O5-H］-、［M-C6H10O5-H2O-H］-、［M-C6H10O5-C6H6O-H］-。结合文献，鉴定化合物15为tectoridin 或者同分异构体［22］。

3.1.4 三萜类化合物

三萜类成分中一般连接多个糖基形成三萜苷，不同取代位上连接葡萄糖、鼠李糖、木糖等单糖。三萜类成分中的苷元五环三萜类结构较稳定，在较高能量下也仅失去糖碎片离子和H2O，多数三萜苷类化合物呈现单糖或寡糖的碎片裂解规律［23］。以对照品oleanolic acid（C30H48O3）为例，在负离子模式下其低能量准分子离子峰为［M-H］-m/z455.351 7，为三萜类化合物母核的特征碎片。翼首草提取物样品中化合物46 的保留时间、特征碎片等与其一致，确认为oleanolic acid；化合物32，负离子模式下其准分子离子峰为［M-H］-m/z1 629.752 8，初步推测分子式为C75H122O38。依次将连接的多个糖基裂解，形成特殊的碎片离子m/z1 305.647 9/［MGlc-Glc-H］-，m/z1 159.590 0/［M-Glc-Glc-Rha-H］-，m/z1 027.548 7/［M-2Glc-Rha-Xyl-H］-，m/z865.496 6/［M-3Glc-Rha-Xyl-H］-，m/z587.394 8/［M-3Glc-Rha-2Xyl-H］-，m/z455.348 9/［ M-3Glc-Rha-3Xyl-H］-。结合数据库检索及文献信息鉴定，确认该化合物为hookeroside C［24］；化合物37 在负离子模式下准分子离子峰为［M-H］-m/z1 305.651 4，推测分子式为C63H102O28。根据碎片m/z1 173.611 3、m/z1 011.555 1、m/z865.497 6、m/z587.391 5、m/z455.352 2 推测其为化合物34 或35 的同分异构体。又根据其脱去脱水木糖、脱水葡萄糖、脱水鼠李糖、脱水木糖、脱水鼠李糖、脱水木糖的顺序，与数据库比对推测化合物37 为oleanolic acid 3-Xyl-Rha-Xyl-Rha-Glc-Xyl ，其为首次在翼首草中发现。化合物40 在负离子模式下准分子离子峰为［M-H］-（m/z1 143.597 3），推测分子式为C57H92O23。根据碎片m/z865.487 4、m/z587.391 5、m/z455.352 2，推测其为三萜类化合物，依次脱去脱水木糖、脱水鼠李糖、脱水鼠李糖、脱水木糖、脱水木糖，推测化合物40 为oleanolic acid -Xyl（1→3）-Xyl（1→3）-Rha（1→3）-Rha（1→3）-Xyl。依此规律共鉴定出18 个三萜类化合物，为化合物30［oleanolic acid -Xyl（1→3）-Rha（1→2）-Xyl］、32（hookeroside C）、33（hookeroside A）、34（hookerside D）、35（hookerosides D 同分异构体）、36［oleanolic acid 3-Xyl（1→4）-Glc（1→4）-Xyl（1→3）-Rha（1→2）-Xyl］、37（oleanolic acid 3-Xyl-Rha-Xyl-Rha-Glc-Xyl）、38［oleanolic acid 3-Glc（1→4）-Xyl（1→3）-Rha（1→2）-Xyl］、39（rivularicin）、40［oleanolic acid-Xyl（1→3）-Xyl（1→3）-Rha（1→3）-Rha（1→3）-Xyl］、41（triploside C）、42（triploside C 同分异构体）、43［oleanolic acid 3-Xyl（1→3）-Rha（1→2）-Xyl］、44（giganteaside D）、45（songoroside A）、46（oleanolic acid）、47（ursolic acid）、48（oleanonic acid）；其中化合物46、47、48 为对照品比对，化合物30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48 为结合文献推测确认。化合物37 和40 为首次在翼首草中发现的三萜类化合物（详见表1）。

3.2 基于多元统计分析的差异化合物的辨识

质谱中导出4 批次药材的原始数据经Progenesis QI 3.0 软件处理，导入Ezinfo 3.0 中进行无监督的PCA 分析。结果显示，在负离子模式下能得到较好的分离（图2A），表明不同提取溶剂影响翼首草有效成分的溶出。

进一步基于有监督的OPLS-DA 分析对翼首草水提取物、醇提取物进行判别分析见图2B 得分图（Score plot，S-plot）见图2C。以变量投影重要度VIP ＞1.0，P＜0.5和Fold change ＞2或＜0.5为筛选条件，对4 批翼首草两种提取物的差异化合物进行筛选，结果共鉴定出16 个特征差异成分，其中2 个环烯醚萜类化合物、10个三萜类化合物（见表2）。

表2 翼首草水提取物和醇提取物差异化合物Tab.2 Information of differential components between WE and EE of P.hookeri

图2 翼首草水提取物、醇提取物PCA图（A）、OPLS-DA图（B）、S-plot图（C）Fig.2 PCA score plot（A），OPLS-DA score plot（B），S-plot（C）of WE and EE of P.hookeri

结果显示，质谱中化合物的相对离子强度可以初步反映其相对含量［17］，因此利用相对离子强度对16 个差异成分进行了半定量分析（见图3）。其中4个化合物为醇提液中所特有oleanolic acid-Xyl（1→3）-Rha（1→2）-Xyl、rivularicin、oleanolic acid-Xyl（1→3）-Xyl（1→3）-Rha（1→3）-Rha（1→3）-Xyl、oleanonic acid，12 个化合物在含量上具有明显差异即水提取物中neochlorogenic acid、chlorogenic acid、quinic acid、swertiamarin 含量较高，可能与化合物自身的溶解性有关；75%乙醇提取物中sylvestroside III、luteolin 7-glucoside 或者kaempferol 5-glucoside 或者luteolin 7-galactoside 以及三萜类化合物（hookerosides D 或者其同分异构体、oleanolic acid 3-Xyl-Rha-Xyl-Rha-Glc-Xyl、triploside C或同分异构体、oleanolic acid、ursolic acid）含量较高，这可能与提取溶剂极性或提取过程中某些化合物发生了降解有关。

图3 翼首草不同提取物差异成分半定量结果Fig.3 Semi-quantification of differential components in two extracts of P.hookeri

4 结论与讨论

本研究利用UPLC-QTOF-MS/MS 快速表征了翼首草水提取物和醇提取物化学轮廓，从4 批翼首草药材中共鉴定了48 个化合物，包括18 个三萜类、18 个环烯醚萜类、9 个苯丙素类等化合物。首次从翼首草中发现5 个化合物，其中1 号化合物经对照品鉴定为quinic acid，其余四个化合物通过裂解规律推断为luteolin 7-glucoside 或者kaempferol 5-glucoside 或者luteolin 7-galactoside、tectoridin 或者同分异构体、oleanolic acid 3-Xyl-Rha-Xyl-Rha-Glc-Xyl、oleanolic acid-Xyl（1→3）-Xyl（1→3）-Rha（1→3）-Rha（1→3）-Xyl。通过PCA 分析和OPLS-DA 辨识出翼首草水提取物和75% 乙醇提取物的16 个差异性成分，其中4 个化合物为醇提液中所特有oleanolic acid-Xyl（1→3）-Rha（1→2）-Xyl、rivularicin、oleanolic acid-Xyl（1→3）-Xyl（1→3）-Rha（1→3）-Rha（1→3）-Xyl、oleanonic acid；12 个化合物在含量上具有明显差异即水提取物中neochlorogenic acid、chlorogenic acid、quinic acid、swertiamarin 含量较高，75%乙醇提取物中sylvestroside III、luteolin 7-glucoside 或者kaempferol 5-glucoside 或者luteolin 7-galactoside、hookerosides D 或其同分异构体、oleanolic acid 3-Xyl-Rha-Xyl-Rha-Glc-Xyl、triploside C 或其同分异构体、oleanolic acid、ursolic acid含量较高。

绿原酸具有很好的抗菌作用［33］，本研究发现翼首草水提取物中含有大量的绿原酸，这解释了翼首草水提取物抗菌效果较好的原因。翼首草中sylvestroside III 等双环环烯醚萜化合物在动物水平具有很好的镇痛作用，在细胞水平具有抗炎作用［34］，翼首草的网络药理学研究发现齐墩果酸、熊果酸、齐墩果酮酸等三萜类化合物是抗风湿性关节炎的活性成分［35］，这些活性成分为翼首草醇提取物的优势成分。研究结果表明不同翼首草提取物中含有活性成分有明显区别，产生的药理作用也有所不同，这为解释不同溶剂翼首草提取物的制剂药效偏向性提供了化学依据，同时在实际应用中也应充分考虑这一特点。