石斛碱和石斛酚对小鼠细胞色素P450表达与活性作用研究

王亚兰，张 笑，韩邦兴，欧阳臻，魏 渊*

（1.江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013；2.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012）

石斛为我国名贵中药植物，其药用始载于《神农本草经》［1］：“味甘平，主伤中，除弊，下气……”。现代研究表明石斛具有广泛的药理活性，包括抗氧化［2］、抗肿瘤［3］、抗肝损伤［4］、抗炎［5］等作用。石斛碱和石斛酚分别是石斛属植物的生物碱类和酚酸类成分，广泛存在于金钗石斛［6］、铁皮石斛［7］和霍山石斛［8］等植物中。石斛碱是一种倍半萜生物碱［9］，2020 版《中国药典》规定金钗石斛中石斛碱的含量不少于0.40%［10］。现代研究发现石斛碱具有抗肿瘤［11］、抗糖尿病［12］、抗流感病毒［13］以及抗肝损伤［14］等多种药理活性。石斛酚是石斛属植物中特有的双苄基化合物，具有抗肿瘤［15］、抗炎［16］、抗白内障［17］和抗氧化［18］生物活性。但石斛碱和石斛酚对细胞色素P450酶的表达与活性的作用鲜有文献报道。

细胞色素P450（Cytochrome P450）又称混合功能氧化酶和单加氧酶，主要在肝脏细胞中表达，是生物转化中重要的I 期酶［19］，对外源物质的解毒、细胞代谢和体内平衡起着关键作用。在所有化合物（普通化学品、天然和生理化合物以及药物）的代谢过程中，超过90%的酶反应是由P450 酶催化的［19］。人体内参与药物代谢的主要P450 酶有CYP3A4（27%）、2D6（13%）、2C9（10%）、2C19（9%）、1A2（9%）、3A5（6%）、1A1（5%）、2B6（4%）和2E1（3%）等成员［20］。因此，诱导或抑制P450 酶是导致药物-药物相互作用（Drug-drug interaction，DDI）主要机制。例如，许多化疗药物能够抑制或诱导CYP 酶系统引起药物相互作用［21］。然而药物可以由一种或多种P450 酶代谢［22］：例如新型口服抗凝药依度沙班通过CYP3A4 代谢，但另一种新型口服抗凝药阿哌沙班则 由 CYP3A4、CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9 和CYP2C19 代谢。多种药物也可能被同一种酶（例如红霉素）代谢或抑制相同的酶，或者可以被一种酶代谢并抑制另一种酶（例如特比萘芬）［23］。因此如果由某个CYP 酶代谢的药物与另一种作为该酶抑制剂的药物联合使用，就会受到DDI的影响：例如美托洛尔和达克替尼合用可导致美托洛尔的血药浓度大幅度升高，从而导致肝损伤［24］。

中药复杂的活性成分可能影响P450 酶的表达与活性［25］。给长期服用中药的人联合用药时，中药中的活性成分可以通过诱导或抑制P450 酶而改变其他药物的代谢，影响其疗效。例如，Ji等人［26］报道了急性肾功能衰竭患者的七叶皂苷钠和银杏叶提取物注射液的联合治疗，银杏叶提取物对CYP2C9和CYP3A4酶的抑制作用可能影响其治疗效果。

石斛具有很高的药用价值，目前还被列入了中国保健品目录和欧盟新食品目录，广泛应用于中国临床和中药复方［27］。本课题组前期对石斛与细胞色素P450酶的相互作用做了相关研究。结果表明，霍 山 石 斛 可 以 诱 导CYP1A1、CYP1A2、CYP2B 和CYP3A 蛋白表达［28-29］，在此并基础上进一步研究了石斛活性成分与P450 酶之间的关系。通过探究石斛碱和石斛酚对小鼠肝脏P450 酶表达和活性的影响，为石斛的安全用药提供指导，以减少不良反应和副作用的发生，确保联合用药的安全性。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器

Spectra Max 190 型酶标仪（美国MD 公司）；SK-1 快速混匀器（江苏中大仪器厂）；Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），TE601-L 电子天平（北京Sartorius 仪器系统有限公司）；Pic017 台式离心机（美国Thermo Fisher 公司）；倒置显微镜（日本Nikon 公司）；Light Cycle 96 荧光定量PCR 仪（瑞士巴赛尔罗氏）；超微量紫外分光光度计（DUO 型号，Bio-Drop 公司）；电泳仪（DYY-6C，北京市六一仪器厂）。

1.2 主要试剂

石斛碱（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y09J9L62594，HPLC≥95%）；石斛酚（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y14D9L77641，HPLC≥98%）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）等检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；山羊抗鼠二抗（A0216）和山羊抗兔二抗（A0208）购自南通碧云天生物技术研究所；兔抗人CYP1A1 多克隆抗体（sc-20772）、鼠抗 人CYP1A2 单克 隆 抗体（sc-53241）、兔 抗 人CYP2A 多克隆抗体（sc-33214）、鼠抗人CYP2B1/2单克隆抗体（sc-73546）和兔抗人CYP3A 多克隆抗体（sc-25845）购自美国SantaCruz 公司；兔抗人CYP2E1 单克隆抗体（BML-CR3271）购自美国Enzo公司；兔抗人CYP2C19 多克隆抗体（ab137015）从美国Abcam 购买；兔抗人CYP2D6 单克隆抗体（PAB19502）购自中国台北Abnova 公司。兔抗人Calnexin 单克隆抗体（10427-2-AP）购自美国Proteintech Group 公司；乙氧基间苯二酚、间苯二酚和β-NADPH 购自上海Aladdin；非那西丁、安非他酮、苯妥英钠和硝苯地平购自萨恩化学技术有限公司。所有其他试剂均为分析纯。

1.3 试验动物

SPF 级C57BL/6 小鼠35 只，8 周龄，雄性，体重20±2 g，购自江苏大学实验动物中心（动物许可证号：SCXK［京］2018-0053）。小鼠适应性饲养1 周后用于实验（25±2℃，相对湿度60%，光/暗周期12h）。在实验期间提供标准的实验室饲料，自由进食和饮水。

2 方法

2.1 分组及给药

将C57BL/6 小鼠随机分成7 组，每组5 只，分别设置为空白组、石斛碱低剂量组（0.5 mg·kg-1）、石斛碱中剂量组（1.5 mg·kg-1）、石斛碱高剂量组（3 mg·kg-1）、石斛酚低剂量组（0.02 mg·kg-1）、石斛酚中剂量组（0.05 mg·kg-1）、石斛酚高剂量组（0.1 mg·kg-1），化合物以0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液溶解。所有实验小鼠每隔24 h 腹腔注射给药1 次，连续给药2 周，空白对照为注射等体积的0.5%CMC-Na 溶液，末次给药完禁食12 h，称重，眼静脉取血，颈椎脱臼法处死小鼠迅速摘除肝脏。所有动物繁殖和实验操作均按照“实验动物关爱和使用指南”进行，并经江苏大学机构动物关爱和使用委员会（UJS-CAER-AP-2018101101）批准。

2.2 Western blot分析

采用差速离心法制备小鼠肝微粒体［30］，取肝组织0.15 g 用冰生理盐水冲洗，放入玻璃管中，加入3 mL 的KCl-蔗糖缓冲液，用组织匀浆器将肝组织匀浆，4℃，1.2×104r·min-1离心20 min。弃去沉淀，将上清液转移到高速离心管中，4℃，4×104r·min-1超高速离心1 h。弃去上清，将沉淀转移到玻璃研磨器中，加入甘油-磷酸缓冲液，用研磨器将沉淀研磨至溶解，分装后，-80℃冰箱保存备用。用BCA 蛋白质浓度分析试剂盒（上海碧云天）测定微粒体悬液中的蛋白质浓度。Western blot 检测肝微粒体中P450 亚型的表达。

用SDS-PAGE胺凝胶电泳分离小鼠肝微粒体的等量蛋白质（5 μg）［31］，然后转移到PVDF 膜上（美国Millipore 公司）。Calnexin 作为内参蛋白。分别用CYP1A1、CYP1A2、CYP2Bs、CYP3As、CYP2C19、CYP2D6 和CYP2E1 的一抗在4℃过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育。用ECL 试剂检测蛋白质条带。使用ChemiDoc XRS成像系统（美国加利福尼亚州大力神Bio-Rad）对化学发光信号进行可视化和分析，然后用Image J软件进行灰度值分析。

2.3 细胞色素P450活性的测定

取对照组、3 mg·kg-1石斛碱组和0.1 mg·kg-1石斛酚组小鼠肝微粒体。以乙氧基二苯醚［32］、非那西丁［33］、硝苯地平［34］、安非他酮［35］和苯妥英钠［36］为探针底物，分别检测小鼠肝微粒体中CYP1A1、CYP1A2、CYP3As、CYP2Bs 和CYP2Cs 酶活性，并优化孵育条件。底物溶于甲醇，并用甲醇连续稀释至所需浓度（5 mg·mL-1）。在磷酸盐缓冲液（pH=7.4）中进行200 μL 体外孵育体系，包括包含10 μL 小鼠肝微粒体、20 μL MgCl2溶液，20 μL 底物溶液、130 μL 磷酸盐缓冲溶液，37℃孵育5 min 后加入20 μL β-NADPH 启动反应。反应结束后向体系中加入200 μL 冰甲醇终止反应。以1×104r·min-1离心10 min，收集上清液进行分析。CYP1A1 酶活性以脱乙基酶（EROD）的活性作为指标，并以每分钟内每克蛋白反应生成试卤灵的量显示。CYP1A2、CYP3As、CYP2Bs 和CYP2Cs 酶活性以探针药物反应前后的转化程度作为检测酶活性的指标［37］，以单位时间内单位蛋白消耗的底物量来表示。

CYP1A1酶活性：肝微粒体蛋白浓度2 mg·mL-1，孵育时间30 min；荧光分光光度计测定荧光值，检测条件为：激发波长569 nm，发射波长585 nm。

CYP1A2 酶活性测定：肝微粒体蛋白浓度0.5 mg·mL-1，孵 育时 间30 min；Supersil AQ-C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱，进样量20 μL，柱温30℃，流速1.0 mL·min-1，流动相为甲醇：水＝48 ：52，检测波长为247 nm。

CYP3As 酶活性测定：肝微粒体蛋白浓度0.5 mg·mL-1，孵 育 时 间30min；Supersil AQ-C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱，进样量20 μL，柱温30℃，流速1.0 mL·min-1，流动相为甲醇：水= 62 ：38，检测波长为214 nm。

CYP2Bs 酶活性测定：肝微粒体蛋白浓度0.5 mg·mL-1，孵育时间30 min；色谱柱为Supersil AQC18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱，进样量20 μL，柱温30℃，流速1.0 mL·min-1，流动相为甲醇：0.01 mol·L-1乙酸铵=55：45（pH=4.0），检测波长为250 nm。

CYP2Cs 酶活性测定：肝微粒体蛋白浓度0.25 mg·mL-1，孵育时间30 min；色谱柱为Supersil AQC18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱，进样量20 μL，柱温30℃，流速1.0 mL·min-1，流动相为甲醇：水=50 ：50，检测波长为240 nm。

2.4 一般肝脏毒理学分析

室温下凝血30 min，3500 r·min-1离心10 min 制备血清，测定血清ALT、AST 浓度。肝组织用冰磷酸盐缓冲液（1：9，w/w）匀浆，3500 r·min-1离心10 min制备肝匀浆液，测定肝组织中GSH 和MDA 含量。其余肝组织用10%中性福尔马林缓冲液固定，进行组织学检查。组织切片（5 μm），H&E 染色，光学显微镜拍照并分析。

2.4 数据分析

所有数据均以x±s 表示。使用SPSS 13.0 对数据进行统计学分析，用单因素方差分析（ANOVA）评价数据的统计学意义。P＜0.05 表示具有统计学意义，P＜0.01表示差异有重要统计学意义。

3 试验结果

3.1 石斛碱和石斛酚对主要P450蛋白表达的影响

3.1.1 石斛碱对细胞色素P450酶蛋白表达的影响

石斛碱对主要P450 酶蛋白表达的影响结果见图1 和表1。石斛碱可以显著诱导CYP1A1、CYP2Bs 蛋白表达（P＜0.01）；石斛碱低、中、高剂量组诱导CYP2C19 蛋白的表达且呈剂量依赖性增加（P＜0.01）。 暂 未 观 察 到 对 其 他P450 酶 的影响。

表1 石斛碱Western blot灰度值分析Tab.1 Western blot results of dendrobine

图1 石斛碱对细胞色素P450酶蛋白表达的影响Fig.1 Effect of dendrobine on cytochrome P450 protein expression

3.1.2 石斛酚对细胞色素P450酶蛋白表达的影响

石斛酚对主要P450 酶蛋白表达的影响结果见图2和表2。结果显示，石斛酚低、中、高剂量组可以显著提升CYP1A1、CYP1A2、CYP2B 和CYP2C19 蛋白表达（P＜0.01）；石斛酚高剂量组可以显著提升CYP3A 蛋白的表达（P＜0.01）；石斛酚低剂量组对CYP2E1蛋白表达存在上调作用（P＜0.05）。

表2 石斛酚Western blot灰度值分析Tab.2 Western blot results of dendrobol

图2 石斛酚对细胞色素P450酶蛋白表达的影响Fig.2 Effect of dendrobol on the expression of cytochrome P450 enzyme protein

3.2 石斛碱和石斛酚对P450酶活性的影响

在细胞色素P450蛋白表达结果的基础上，进一步研究了石斛碱和石斛酚对小鼠肝脏CYP1A1、CYP1A2、CYP3As、CYP2Bs 和CYP2Cs 酶活性的影响。结果见表3，石斛碱能显著提高CYP1A1的酶活性（表3.1，P＜0.01），而对CYP1A2、CYP2Bs、CYP2Cs和CYP3As 的活性无显著影响。石斛酚对CYP1A1、CYP1A2、CYP3As、CYP2Bs 和CYP2Cs 活性无显著影响。

表3 小鼠肝微粒体细胞色素P450酶活性Tab.3 Activity of P450 enzymes in mouse liver microsomes

3.3 肝脏组织学

小鼠肝组织病理切片图如图3所示，图3中A为空白对照组。由图可见，小鼠肝组织形态正常，肝细胞排列整齐，界限分明，并未出现异常现象。与空白组相比，不同剂量石斛碱和石斛酚组与空白组相似，肝组织形态正常，肝细胞排列整齐，边界清晰，并未见明显细胞坏死。

图3 小鼠肝组织病理变化（H&E，染色200×）Fig.3 Pathological changes of liver tissue in mice（H&E staining，200×）

3.4 血清和肝组织生化分析

从表4中可以看出，与空白组相比，石斛酚高剂量组的AST 有所升高（P＜0.01），其余组别ALT 和AST值均低于空白组。石斛碱和石斛酚对小鼠肝脏GSH 和MDA 的影响结果见表5，石斛酚高剂量组MDA 较空白组升高（P＜0.05），其余各组均降低，而石斛碱和石斛酚均升高小鼠肝脏中的GSH值。

表4 石斛碱和石斛酚对小鼠肝脏指数的影响Tab.4 Effects of dendrobine and gigantol on liver index in mice

表5 石斛碱和石斛酚对小鼠肝脏MDA和GSH的影响Tab.5 Effects of dendrobine and gigantol on MDA and GSH in mice liver

4 讨论

细胞色素P450 酶的活性通常与它的表达是一致的，例如炎症抑制了某些细胞色素P450的蛋白表达，从而进一步抑制酶的活性［38］。另一项研究表明，长期吸烟对CYP2C11 和CYP3A1 酶活性有明显的抑制作用，而对CYP1A2酶活性是诱导作用，并且蛋白表达水平与活性作用一致［39］。中药活性成分对CYP 酶的表达和活性也有类似的影响。Wang 等人［40］发现牡荆素在体内抑制大鼠肝脏CYP3A1 活性，对酶表达水平作用与活性作用一致。丹参酮ⅡA 是丹参中活性成分之一，可以提高CYP1A2 及CYP2E1的蛋白表达以及活性［41］。

有趣的是，本研究结果表明石斛碱能诱导CYP1A1、CYP2Bs 和CYP2Cs 的表达，石斛酚能诱导CYP1A1、CYP2Bs、CYP2Cs 和CYP2E1 的表达，但只有石斛碱对CYP1A1 酶活性存在诱导作用。石斛碱和石斛酚可以诱导这几种P450酶的蛋白表达，但对这些酶的活性并没有显著影响，这可能与多方面的原因有关。石斛碱与石斛酚可能对这些P450 酶的蛋白表达诱导作用较小，不足以改变它们的活性。酶活性受到很多因素的影响，如底物、温度、时间等。本实验采用的检测方法是体外底物探针法，与体内环境有一定的差异；且实验方法仅选取一种特异性底物测定酶活性，大部分酶活性还会受到其他底物的影响。

石斛碱和石斛酚对CYP1A1 和CYP1A2 蛋白表达作用与课题组前期霍山石斛鲜榨汁的研究结果相一致［28-29］。 CYP1A1 和CYP1A2 可以代谢多种化合物和药物，然而，这两种酶具有明显重叠的底物的特异性，许多化合物可以显著影响CYP1A1 和CYP1A2 对新陈代谢的相对贡献。例如，在3-甲基胆蒽处理的大鼠微粒体中，一些化合物主要被CYP1A1氧化，而CYP1A2起次要作用［42］。

本实验结果显示，石斛碱对CYP1A1 酶的活性具有上调作用。CYP1A1酶是细胞色素P450酶家族的主要酶之一，参与临床中约2.5%的药物代谢，如氯丙咪嗪、丙咪嗪、米塞林和度洛西丁等［43］。已有不少中药及其活性成分调节CYP1A1 酶活性的研究，如半枝连中的黄酮类成分可以抑制CYP1A1 酶的活性［44］；花楸猕猴桃根可以降低CYP1A1 酶的活性［45］；大青叶可以提高CYP1A1 酶的活性［46］；黄芩中黄酮类成分可以抑制CYP1A1 酶的活性［47］；白藜芦醇可以抑制CYP1A1 酶的活性［48］。这些研究表明CYP1A1 酶在药物代谢过程中发挥重要作用。石斛碱诱导CYP1A1 的活性，可能加快由该酶介导的药物代谢速度，导致不良反应。CYP1A1 被广泛认为是与二恶英、二恶英类化合物和多环芳烃的毒性和致癌性有关［49］。尽管大多数研究都集中在CYP1A1的致癌作用上［50］，但最近的研究发现，这种酶在解毒和化学预防中发挥着重要作用［51］。CYP1A1 可能作为一种致癌物解毒酶发挥作用，天然化合物具有的化学预防活性提供了对该酶抗癌保护作用的进一步的研究方向［52］。本研究结果表明，石斛碱和石斛酚均能显著诱导CYP1A1 的表达，这可能与石斛潜在的抗癌机制有关。

生化结果显示，石斛酚高剂量组的血清AST 以及肝脏MDA 升高，而肝脏组织形态正常，表明石斛酚在该剂量下对小鼠肝脏存在轻微损伤，提示在临床应用上需注意石斛酚的剂量风险。此外，在本研究中使用的石斛碱低中高剂量和石斛酚低中剂量对小鼠是安全无毒的，对评估石斛酚和石斛碱的安全性具有重要意义。

综上所述，本研究证实了石斛碱能提高小鼠CYP1A1 酶活性，提示在联合使用含石斛碱药物时需注意CYP1A1 酶代谢的药物的剂量安全，确保这些药物达到合理疗效。本研究有助于更好地了解含石斛碱和石斛酚的中药之间的药物相互作用。然而本研究结果仅限于动物实验，尽管我们的数据对石斛药物的长期应用具有很强的指导意义，但还需做进一步的临床试验来验证。