猪伪狂犬病病毒gE 基因缺失株毒株的鉴定

林 鸷,何锡忠,朱永军,丁卫星,彭丽英

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海 201106)

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性传染病[1],1813 年在美国的牛群中首次发现,1902 年匈牙利科学家Aujeszky 将其命名为‘Aujeszky disease’[2]。

伪狂犬病流行广泛,已在40 多个国家或地区暴发。 1947 年我国首次报道了猫伪狂犬病,1956 年在哺乳猪群中发现伪狂犬病[3]。 经典的伪狂犬病毒可致母猪流产、不孕、死胎多,仔猪感染后多数一周内死亡。 与经典伪狂犬病毒相比,变异毒株毒力更强,且对各阶段猪都有危害,对新生仔猪有100%致死率。猪只感染后会出现发热、食欲不振、消瘦、腹泻等症状,还有的先咳后喘,出现流鼻涕流眼泪等症状,常被误认为气喘病或感冒,导致未能及时有效采取措施[4-9]。 2011 年至今,由变异的猪伪狂犬病病毒引起的猪伪狂犬病在全国多数省份暴发,给猪场带来很大的经济损失。

PRV-gE基因是病毒复制的非必需基因,该基因的缺失可以降低病毒的嗜神经性且不影响免疫原性,可以用来区分野毒感染和疫苗免疫[10]。 传统的疫苗已经不能完全抵挡变异毒株的侵袭,目前急需更新疫苗毒株[11]。 本研究将分离得到的PRV 变异毒株部分gE基因敲除[12]后进行纯净度、外源病毒检测,特异性试验,毒力试验及免疫原性试验,旨在评估构建的gE基因缺失毒株能否用于灭活疫苗的制备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

PRVSX-gE 基因缺失毒株(108.33TCID50∕mL)、攻毒用强毒株PRVBJ病毒(108.33TCID50∕mL,实验室分离得到)、BVDV、CSFV 及PCV-2 均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.1.2 细胞

STHN、PK15、MDBK 细胞由上海农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.1.3 培养基

细胞用培养基DMEM、胰酶均购于GIBCO 公司;硫乙醇盐流体培养基(TG)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)均购自中国兽医药品监察所;液体培养基和固体培养基均购自中国兽医药品监察所。

1.1.4 荧光抗体检测试剂盒

牛病毒性腹泻∕黏膜病毒、猪圆环病毒2 型及猪瘟病毒间接荧光检测试剂盒购自中国兽医药品监察所。

1.1.5 伪狂犬病病毒特异性血清制备

根据TCID50测定结果将PRVSX-gE 株病毒浓度调整为108.33TCID50∕mL,0.02%BEI 灭活后加入2%的硫代硫酸钠中和1 h,灭活病毒液接种ST 细胞,灭活检验合格后加入佐剂制备成灭活疫苗。 取5 头28 日龄左右的仔猪(PRV 抗原阴性和gB-ELISA 抗体阴性)进行免疫,每头接种2 mL,2 周后加强免疫一次,二免后56 d 采血,制备PRVSX-gE 特异性血清,于-80 ℃冰箱保存。

1.1.6 诊断试剂盒

PRV 的ELISA 诊断试剂盒购自美国IDEXX 公司。

1.1.7 实验动物

PRV 抗体阴性仔猪(经试剂盒检测阴性)购自江苏某猪场。 体重20 g 左右SPF 级ICR 小鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PRVSX-gE 病毒传代

将鉴定好的PRVSX-gE 株病毒按1∶1 000 比例接种STHN细胞,37 ℃培养40 h,细胞病变达90%以上时收集,冻融3 次,合并后-20 ℃保存。 取小样待检。 将病毒液加10%血清,混匀,分装于西林瓶中,于-80 ℃长期保存。 按同样方法连续传代至35 代,冻存各代次病毒并进行毒价测定。

1.2.2 TCID50测定

将收获的各代次病毒毒液用细胞营养液DMEM 作10 倍系列稀释,取稀释度10-4—10-8接种长势良好的STHN细胞(96 孔细胞培养板),每孔0.1 mL,设不接种病毒的正常细胞孔为对照。 37 ℃、5%CO2条件下培养5 d,观察细胞病变,Reed-Muench 法计算TCID50。

1.2.3 无菌、支原体、外源病毒检验

按《中华人民共和国兽药典》[13]附录对收获的各代次病毒液进行无菌检验。 按《中华人民共和国兽药典》[13]附录对抽提的1、5、10、15、20、25、30、35 代病毒液进行支原体及外源病毒检验。

1.2.4 PRVSX-gE 株的毒力试验

用108.0TCID50∕mL 的PRVSX-gE F35 代病毒液对28 日龄的5 头仔猪进行攻毒,每头4 mL(肌注3 mL,滴鼻1 mL)。 对照组仔猪5 头,不攻毒。 观察14 d,记录仔猪的临床反应及体温检测。

1.2.5 PRVSX-gE 株免疫原性稳定性试验

1.2.5.1 疫苗配制

将含量均大于108.33TCID50∕mL 的病毒与SDA28VG 佐剂以3∶1的比例配制疫苗备用。

1.2.5.2 对小鼠的免疫原性试验

取40 只体重20 g 左右健康小鼠,随机分成2 组,每组20 只,免疫组皮下注射F35 代PRVSX-gE 株灭活疫苗,0.3 mL∕只,免疫后14 d 后再次皮下注射0.3 mL∕只,另1 组不注射疫苗(对照组),二免14 d 后,两组小鼠分别皮下注射强毒PRVBJ(108.0TCID50∕mL),剂量为0.2 mL∕只(含50 LD50),连续观察10 d。 统计小鼠的临床发病∕死亡情况。

1.2.5.3 对猪的免疫原性试验

取15 头28 日龄左右健康仔猪(PRV 抗原阴性和gB-ELISA 抗体阴性),随机分为3 组,每组5 头,第1 组分别肌肉注射F35 PRVSX-gE 灭活疫苗,2 mL∕头;第2 组分别肌肉注射F35 PRVSX-gE 灭活疫苗,2 mL∕头;第3 组为对照,不注射疫苗。 第1 组免疫后观察14 d,观察仔猪的临床反应及体温检测。 第2 组分别于免疫后7 d、14 d、28 d 采血,分离血清,检测PRVSX-gE 和gB 抗体;并于免疫后28 d 连同对照组滴鼻PRVBJ强毒株(105.0TCID50∕mL),1 mL∕头,观察仔猪的发病及死亡情况。

1.2.6 PRVSX-gE 株特异性试验

用200 TCID50病毒液与等量PRVSX-gE 免疫后的血清中和1 h,取8 瓶细胞分2 组,每组4 瓶,一组接种中和液,另一组接种200 TCID50病毒液,每瓶1 mL,37 ℃吸附1 h 后每瓶加细胞维持液9 mL。 正常细胞为对照组,每瓶加细胞维持液10 mL。 置于37 ℃、5%CO2培养箱继续培养,5—7 d 后观察细胞的病变情况。

2 结果与分析

2.1 不同代次PRVSX-gE 株病毒含量检验

由表1 可知,不同代次之间病毒滴度无显著差异,病毒含量均不低于108.33TCID50∕mL。

表1 PRVSX-gE 株不同代次病毒含量Table 1 Virus titer of different generations of PRVSX-gE strain TCID50·mL -1

2.2 不同代次PRVSX-gE 株无菌、支原体及外源病毒检验

由表2 可知,不同代次之间病毒液均无菌生长;且无支原体生长,无外源病毒污染。

表2 PRVSX-gE 株不同代次无菌、支原体、外源病毒检验Table 2 Sterility test,mycoplasma test and exogenous virus test results of PRVSX-gE strain

2.3 PRVSX-gE 株毒力检验

攻毒小组的仔猪体温升高、食欲减退、消瘦,1 头猪有腹泻症状,7 d 后出现神经症状,5 头猪全部发病。 对照猪无临床症状。

2.4 免疫原性检验

2.4.1 对小鼠的免疫原性检验

由表3 可知,用PRVSX-gE 株病毒(108.33TCID50∕mL)配制的疫苗免疫小鼠后进行攻毒,对照组全部死亡,各代病毒制备的疫苗对小鼠保护率达90%以上。

表3 猪伪狂犬病灭活疫苗(PRVSX-gE 株)免疫小鼠的免疫原性检验Table 3 Immunogenicity test of pig pseudorabies inactivated vaccine(PRVSX-gE strain) in mice

2.4.2 对仔猪的免疫原性检验

用PRVSX-gE 株病毒(108.33TCID50∕mL)配制的疫苗免疫后,仔猪无体温升高,也未出现应激反应等,说明疫苗安全性好。 接种PRVSX-gE 株病毒(108.33TCID50∕mL)配制的疫苗7 d 后仔猪抗体开始出现阳性,接种28 d 后抗体中和效价不低于1∶20,而对照组抗体为阴性。 接种后28 d,用PRV 强毒攻击,免疫组未检测到病毒,且无体温升高、食欲减退、腹泻及神经症状等;对照组均发病,其中2 头死亡。 表明PRVSX-gE毒种具有良好的免疫原性,免疫猪能抵抗PRV 强毒攻击(表4)。

表4 猪伪狂犬病灭活疫苗(PRVSX-gE 株)免疫仔猪的免疫原性检验Table 4 Immunogenicity test of pig pseudorabies inactivated vaccine(PRVSX-gE strain) in pigs

2.5 病毒特异性鉴定试验

用200 TCID50病毒液与等量PRVSX-gE 免疫后的血清中和,中和后的液体接种STHN细胞,细胞未出现病变;而200 TCID50病毒液直接接种STHN细胞,则细胞出现圆缩特征性病变。

3 讨论

PRVSX-gE 病毒液对仔猪进行攻毒后可致仔猪发病,说明本实验室构建的PRVSX-gE 具有一定的毒力,可作为制备灭活疫苗的候选株。

将PRVSX-gE 株病毒在ST 细胞上连续传至35 代,各代病毒培养物分别进行了毒价的测定及无菌检验,结果显示,不同代次的毒价稳定并且无细菌和霉菌污染;第1、5、10、15、20、25、30、35 代病毒培养物支原体及外源病毒检测显示,各代次的种毒无支原体和外源病毒的污染。

小鼠免疫试验中,免疫组对小鼠保护率均在90%及以上;在仔猪免疫试验中,免疫组在猪免疫7 d后,产生抗体反应,免疫28 d 后用PRV 强毒攻击,免疫组猪未检测到病毒,也未出现PRV 感染猪的临床症状,说明PRVSX-gE 株对猪和小鼠都具有良好的免疫原性。

猪伪狂犬病的流行对猪场造成的损失极大,疫苗免疫是防止该病流行的最有效措施。 PRVSX-gE 株毒种的分析可为PRVSX-gE 株的灭活疫苗研究奠定基础。